產(chǎn)品簡介

Rhod-2雖然是最受歡迎的紅色熒光Ca2+熒光探針，但Rhod-2的線粒體定位和細胞中高基底Ca2+信號使其在某些細胞應用中嚴重受限制。另外，Rhod-2在488nm處很不理想的激發(fā)波長使其在某些只有488nm激發(fā)光源的儀器比如FLIPRTM上信號很弱。Rhod-4正是根據(jù)這些缺陷而改進的，具有以下特征：

1） Rhod-4的最大激發(fā)和發(fā)射波長是530nm和555nm。雖然Rhod-4最大激發(fā)波長是530nm，但在488nm處激發(fā)下的信號也相當強。除了能在514nm，532nm和546nm的長波長激發(fā)之外，Rhod-4用氬離子激發(fā)器在488nm激發(fā)下也能得到理想的熒光信號。Rhod-4隨著增加的Ca2+濃度熒光信號而增強（555nm發(fā)射波長），一旦與Ca2+結合熒光約增強＞200倍。由于許多細胞受刺激后的Ca2+濃度提高通常是5~10倍，因此，Rhod-4是一款優(yōu)秀的檢測此范圍內(nèi)Ca2+濃度變化的高靈敏探針。

2） 一旦受激動劑刺激后，Rhod-4在細胞內(nèi)的熒光明顯強于Rhod-2（信噪比）。更重要的是，Rhod-4主要定位在細胞胞漿內(nèi)，不像Rhod-2主要定位在線粒體。另外，Rhod-4具更低的溫度依賴性的細胞加載特性，不管室溫還是37℃產(chǎn)生相似的結果。這一特征使Rhod-4比Rhod-2在HTS應用中更有優(yōu)勢。

Rhod-4, AM是Rhod-2的一種乙酰甲酯衍生物，具有細胞膜滲透性，只需簡單培養(yǎng)，即可輕易進入細胞。一旦進入細胞內(nèi)，即被其內(nèi)酯酶剪切生成不具膜滲透性的Rhod-4，從而滯留在胞內(nèi)以發(fā)揮相應生理功能。本品以凍干粉的形式提供，使用時只需經(jīng)無水DMSO充分溶解，配置成2~5mM的儲存液，并依據(jù)具體實驗和相關文獻資料調(diào)整到需要的工作濃度即可。

基本特性

1） 同義名：Rhod-4, Acetoxymethyl Ester

2） 分子量：1015.96

3） 外觀：紅色固體

4） 最大激發(fā)/發(fā)射波長：530/555 nm

5） Kd（Ca2+結合）：525NM

6） 溶解性：溶于DMSO（2~5mM）

保存與運輸方法

保存：-20℃干燥避光保存，至少一年有效。

運輸：室溫運輸。

注意事項

1） 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2） 乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請在干燥的環(huán)境放至室溫后再開封。由于試劑微量，開封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3） Rhod-4, AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可在20-25℃溫育片刻至全部融解后使用。

4） Rhod-4, AM第一次使用，建議儲存液現(xiàn)配現(xiàn)用，分裝成單次用量，嚴格做到≤-20℃密封干燥凍存，以防止受潮。為了保證良好的實驗效果，盡量在短時間內(nèi)使用。

5） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

【注意】以下使用方法僅用作參考，可根據(jù)具體的實驗條件做出調(diào)整。

A， 試劑準備

1） 配制Pluronic F-127母液：稱取100mg Pluronic F-127粉末（貨號：S1163）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2） HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3) 或者其他生理緩沖液

B，操作步驟

1） 用無水DMSO溶解Rhod-4, AM配制成2-5mM的儲存液，或將已配好的Rhod-4, AM儲存液取出于室溫回溫。（如：若配制成4mM的母液，需向50μg Rhod-4, AM中加入12.3μl 無水DMSO）。準備Rhod-4, AM工作液之前，有時需要往Rhod-4, AM儲存液中加入適量的20% Pluronic F-127溶液，以增強AM探針的水溶性。

【注①】：Rhod-4, AM染色工作液制備前，添加等體積20% Pluronic F-127溶液到Rhod-4, AM+DMSO儲存液，從而使Pluronic F-127的最終工作濃度約為0.02%。

【注②】：Pluronic F-127可以防止AM探針在溶液中聚合并促使探針更好進入細胞。但Pluronic F-127可降低AM探針的穩(wěn)定性，因此只建議在配制工作液時加入，不建議加入儲存液長期保存。

2） 用HHBS或其他生理緩沖液將 Rhod-4, AM+DMSO儲存液稀釋到1-10μM的工作液。

【注①】：Rhod-4,AM應用在大部分細胞的推薦加載濃度為4-5μM，具體的使用濃度需根據(jù)實驗要求進行優(yōu)化。為了避免過度加載造成細胞毒性，建議在取得有效結果的基礎上盡量使用最低探針濃度。

【注②】：Rhod-4, AM工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復凍存。

3） 【可選】如果細胞內(nèi)含有機陰離子轉運體，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能需要加入細胞培養(yǎng)基內(nèi)，以降低去酯化探針的泄露水平。

【注①】：丙磺舒或磺吡酮儲存液相當偏堿，因此加入培養(yǎng)基后需要重新調(diào)整pH。

4） 將準備好的Rhod-4, AM工作液加入細胞，加入量以覆蓋細胞為準。室溫或37℃孵育30min-1h。

【注①】：若使用含血清的培養(yǎng)基，血清內(nèi)酯酶會降解AM，從而降低Rhod-4, AM加載效果。而含酚紅培養(yǎng)基會使本底值略偏高，建議加入染色工作液前，對細胞清洗2~3次。

【注②】：關于孵育的時間，如果首次做實驗不能確定，建議先孵育30min，看熒光效果；如果細胞死亡較多，適當縮短時間；如果熒光強度太弱，適當延長時間。

【注③】：降低探針加載溫度可能會降低探針的區(qū)室化現(xiàn)象。

5） 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉運體抑制劑如2.5mM丙磺舒的緩沖液）清洗細胞1~2次，以去除殘留探針。

6） 室溫再孵育30min以保證細胞內(nèi)AM的完全去酯化。

7） 用適當?shù)膬x器如激光共聚焦、流式細胞儀、熒光酶標儀，以及波長Ex/Em=530/555 nm來進行檢測。

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