產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡介

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）的結(jié)合阻止絲狀肌動蛋白（微絲）的解離，穩(wěn)定微絲結(jié)構(gòu)，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動態(tài)平衡。此特性使得肌動蛋白聚合發(fā)生的臨界濃度（CC）降至＜1μg/mL，因此，可用作一種聚合促進劑。此外，鬼筆環(huán)肽還可抑制F-actin的ATP水解活性。

鬼筆環(huán)肽-AF 488標(biāo)記探針會選擇性地結(jié)合F-肌動蛋白,一般在納摩爾濃度下使用，鬼筆環(huán)肽衍生物是非常方便的熒光探針，用于標(biāo)記、鑒定和定量甲醛固定和透化組織切片中的F-肌動蛋白，細胞培養(yǎng)物或無細胞實驗。肌動蛋白是一種球狀的，大約42kDa的蛋白質(zhì)，幾乎存在于所有真核細胞中。 它也是最高度保守的蛋白質(zhì)之一，與藻類和人類不同的物種相差不超過20％。肌動蛋白參與許多重要的細胞過程，包括肌肉收縮、細胞運動、細胞分裂和胞質(zhì)分裂、囊泡和細胞器運動、細胞信號傳導(dǎo)，以及細胞連接和細胞形狀的建立和維持。

鬼筆環(huán)肽比肌動蛋白單體更緊密地結(jié)合肌動蛋白絲，導(dǎo)致肌動蛋白亞基從絲狀末端解離的速率常數(shù)降低，基本上通過防止絲解聚來穩(wěn)定肌動蛋白絲。此外，發(fā)現(xiàn)鬼筆環(huán)肽抑制F-肌動蛋白的ATP水解活性。鬼筆環(huán)肽在細胞中以不同濃度起作用不同。當(dāng)以低濃度引入細胞質(zhì)時，鬼筆環(huán)肽將較少聚合形式的細胞質(zhì)肌動蛋白以及微絲蛋白聚集成聚集的肌動蛋白聚合物的穩(wěn)定“島”，但它不會干擾應(yīng)力纖維，即厚的微絲束。鬼筆環(huán)肽的性質(zhì)是通過用熒光類似物標(biāo)記鬼筆環(huán)肽并用它們?nèi)旧拥鞍捉z用于光學(xué)顯微鏡來研究F-肌動蛋白在細胞中的分布的有用工具。鬼筆環(huán)肽的熒光衍生物已經(jīng)證明在定位活細胞或固定細胞中的肌動蛋白絲以及在體外可視化單個肌動蛋白絲方面非常有用。熒光鬼筆環(huán)肽衍生物已被用作高分辨率肌動蛋白研究中的重要工具。

本品以1000×儲存液形式（溶于DMSO）提供，按照100μl/孔（96孔板），總共可做300T。

注意事項：   

鬼筆環(huán)肽  的分子量小，很容易通過細胞，不需要對細胞進行冷丙酮和TRITON X-100處理。毒性較大，戴上手套操作。

有幾種方法都能用來染色組織細胞培養(yǎng)物內(nèi)的肌動蛋白絲（F-actin）染色，其中，固定步驟在獲得可信且具代表性的細胞F-actin分布情況中至關(guān)重要。固定步驟基于實驗自身需求來選擇。多聚甲醛或戊二醛都能得到優(yōu)秀的F-actin染色和良好的板狀偽足維持保存。

自備實驗材料

1.1 TRITC-鬼筆環(huán)肽（貨號LX4530）

1.2 1×PBS Buffer（pH 7.4）, for Cell Culture（貨號 SH30256.01）

1.3 固定液（溶于PBS的4%多聚甲醛，pH 7.0）

1.4 破膜液（溶于PBS的0.5% Triton X-100）

1.5 抗熒光淬滅劑

1.6 （可選）即用型PI染色液（貨號 4209）

1.7 （可選）BSA, Standard Grade（貨號 J8660）

1.8 蓋玻片密封液（透明指甲油）

二、染色工作液準(zhǔn)備

2.1 于實驗前將低溫保存的iFluor 488 Phalloidin置于室溫回溫至少20min，低速離心后才開瓶。第一次使用請將本品按照單次用量進行分裝，置于-20℃避光保存，一年穩(wěn)定。

2.2 本品以1000×DMSO儲存液形式提供。開始實驗前，使用1×PBS Buffer（pH 7.4）將其稀釋到1×染色工作液（比如1μl儲存液加入1ml PBS Buffer），用槍吹勻即可。

【注①】：以96孔板為檢測體系，按照100μl/孔來計算，準(zhǔn)備足量的染色工作液；也可對細胞爬片進行染色，但需調(diào)整染色工作液的用量，以能覆蓋住細胞為準(zhǔn)。

【注②】：最佳的工作濃度和孵育時間取決于特定的應(yīng)用。根據(jù)特定的細胞類型和/或細胞/組織對探針的通透性來調(diào)整合適的染色條件。

【注③】：可使用含1% BSA的PBS Buffer稀釋儲存液，能夠降低非特異背景染色，也能最小化鬼筆環(huán)肽粘附到管壁的可能性。

【注④】：染色工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，室溫避光保存。

三、染色流程（以96孔板為例）

3.1 用黑框/透明底的96孔板進行細胞培養(yǎng)，使其貼壁生長達到70-80%的匯合度。

3.2 吸掉培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的1×PBS Buffer（pH 7.4）清洗細胞2次。

3.3 用溶于PBS的4%多聚甲醛固定細胞，室溫固定10-30min?！咀⒁狻浚汗潭ㄟ^程中甲醇能破壞肌動蛋白，因此，固定液中最好避免接觸任何甲醇。最好的固定液是無甲醇的甲醛。

3.4 用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.5 用破膜緩沖液透化細胞，室溫處理5min。

3.6 用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.7 取100μl現(xiàn)配的iFluor 488 Phalloidin染色工作液到每個孔內(nèi)，室溫避光孵育30-90min。

【注意】：若有需要，此時可加入即用型PI染色液或其他不同于iFluor 488熒光光譜的細胞核染色液。

3.8 用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.9 加抗熒光淬滅劑（如Fluoromount-GTM）到孔內(nèi)保護熒光。

3.10 熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果，選擇iFluor 488激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=492/518nm）。若做細胞核染色，選擇合適濾片，比如DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。

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