產(chǎn)品信息

 1.產(chǎn)品概述

免疫共沉淀Co-IP（Co-Immunoprecipitation）是基于抗體和抗原之間結(jié)合的專一性用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。其原理是細胞在非變性條件下被裂解時，細胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用體被保留下來，然后利用目標蛋白質(zhì)特異性抗體進行免疫沉淀。沉淀得到的蛋白質(zhì)復(fù)合體能夠通過變性凝膠電泳分離開來，以此定性或定量分析幾種蛋白質(zhì)間相互作用。

2.試劑

3.材料

 Poly Mac Tips  35個

4.實驗步驟

1. 蛋白提取

1) 細胞樣本

1 洗滌：預(yù)冷的 1 ml  1×PBS 洗滌樣品（約 1×10⁷個細胞）2 次，最后一次吸干 1×PBS；

2 裂解：根據(jù)細胞量加入 1 ml Cell lysis buffer、10 ul Protease inhibitors，冰上充分裂解 20~30 min，期間顛倒混勻 3 次，再超聲3次，每次5 sec。

3 離心：4℃，13000 g，15 min，收集上清；

4 測BCA，將收集的上清用Cell lysis buffer稀釋到1ug/ul。

2) 組織樣本

1 研磨：取新鮮組織或深低溫組織（不少于 0.3g），置于研缽中，用液氮進行研磨，轉(zhuǎn)移組織粉末至新的 EP 管中；

2 裂解：加入 1 ml Cell lysis buffer、10 ul Protease inhibitors，冰上充分裂解 20~30min，期間顛倒混勻 3 次；

3 離心：4℃，13000 g，15 min，收集上清。

4 測BCA，將收集的上清用Cell lysis buffer稀釋到1ug/ul。

2.蛋白與抗體孵育

1 將步驟 1 得到的樣品，取 100 μL 作為 Input 組，取 900 μL 作為 IP 組，Input 組-80℃保存待用，IP 組管加入 2~5 μg 目的抗體；

2 4℃，垂直混勻器搖動孵育過夜。

（一般每個IP樣本需200-500μl細胞裂解物，濃度在1μg/μL左右，以下步驟以200μl細胞裂解物進行IP為例）

3. Protein-A/G 磁珠懸液準備

1 取 20 ul Protein A/G-Beads，4℃，瞬離棄上清；

2 加入 500 ul 預(yù)冷的Cell lysis buffer，混勻，瞬離棄上清，再重復(fù)洗滌 1 次；

3 用 100 ul 預(yù)冷的Cell lysis buffer 將 Protein A/G-Beads 配成懸液。

4. Protein-A/G 磁珠與抗體結(jié)合

1 取步驟 3 得到的 100 μL Protein A/G-Beads 懸浮液加入到 IP 組 EP 管中，4℃，垂直混勻器搖動 2~3 h；

5.洗滌、洗脫

1 將步驟 4 的 IP 組樣品，轉(zhuǎn)入 Poly Mac Tips中,500rpm,60 ses；

2 加入200ul Wash buffer I 轉(zhuǎn)IP樣品于 Poly Mac Tips中（盡量多的將IP樣品殘留轉(zhuǎn)移至 Poly Mac Tips中），500 rpm,1 min，再重復(fù)洗滌1次。

3 用 200ul Wash buffer II 轉(zhuǎn)IP樣品于 Poly Mac Tips中（盡量多的將IP樣品殘留轉(zhuǎn)移至 Poly Mac Tips中），500 rpm,1 min，再重復(fù)洗滌1次；

4 棄過濾液，標記新的EP管待用，加入100 ul Elution buffer,500 rpm,40 sec。

5 在收集的樣品中加入10 ul Neutralization buffer。

6 重復(fù)4、5步驟，收集220ul樣品，殘余用注射器吹入EP管，渦勻離心，-80℃保存待用。

5. 質(zhì)譜檢測（選擇一）

6. western blot（選擇二）

8.注意事項

本產(chǎn)品Protease inhibitor 對人體有毒，操作時要特別小心，并注意有效防護以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)；

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究使用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

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