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雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit

貨號(hào) FBK001 售價(jià)(元) 856
規(guī)格 100T CAS號(hào)
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貨號(hào)

產(chǎn)品名稱(chēng)

規(guī)格

價(jià)格

FBK001

雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit

100T

 856

雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit),是先以螢光素(luciferin)為底物來(lái)檢測(cè)螢火蟲(chóng)螢光素酶(Firefly luciferase),后以腸腔素(coelenterazine)為底物來(lái)檢測(cè)海腎螢光素酶(Renilla luciferase),并且在后續(xù)加入海腎螢光素酶底物時(shí),同時(shí)加入抑制螢火蟲(chóng)熒光素酶催化luciferin發(fā)光的物質(zhì),使后續(xù)檢測(cè)僅僅檢測(cè)到海腎螢光素酶的活性,實(shí)現(xiàn)雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。
螢火蟲(chóng)螢光素酶是一種分子量約為61kD的蛋白,在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下,可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的過(guò)程中,會(huì)發(fā)出生物螢光(bioluminescence)。海腎螢光素酶是一種分子量約為36kD的蛋白,在氧氣存在的條件下,可以催化coelenterazine氧化成coelenteramide,在coelenterazine氧化的過(guò)程中也會(huì)發(fā)出生物螢光。生物螢光可以通過(guò)化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或液閃測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定。本試劑盒的檢測(cè)原理參考圖1.

雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒為檢測(cè)基因的表達(dá)量提供有效的手段,在DLR?檢測(cè)中,螢火蟲(chóng)螢光素酶(Firefly luciferase)和海腎螢光素酶(Renilla luciferase)的活性可在單個(gè)樣品中依次檢測(cè)。先以螢光素(Luciferin)為底物來(lái)檢測(cè)螢火蟲(chóng)螢光素酶的活性,然后加入抑制螢火蟲(chóng)螢光素酶催化的物質(zhì),同時(shí)加入腔腸素(Coelenterazine)檢測(cè)海腎螢光素酶的活性,實(shí)現(xiàn)雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。通過(guò)螢光素酶和其底物這一生物發(fā)光體系,可以非常靈敏、高效地檢測(cè)基因的表達(dá)。通常把感興趣基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或?5'?啟動(dòng)子區(qū)克隆在Luciferase?的上游,或把3'-UTR?區(qū)克隆在Luciferase?的下游,構(gòu)建成報(bào)告基因(Reporter gene)質(zhì)粒,然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞,用適當(dāng)藥物等處理細(xì)胞后裂解細(xì)胞,通過(guò)檢測(cè)螢光素酶活性的高低來(lái)判斷藥物處理等對(duì)目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。海腎螢光素酶更多地被用作檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)參,以消除細(xì)胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染效率的差異。

螢火蟲(chóng)螢光素酶催化luciferin發(fā)光的最強(qiáng)發(fā)光波長(zhǎng)為560nm。海腎螢光素酶催化coelenterazine發(fā)光的最強(qiáng)發(fā)光波長(zhǎng)為465nm。

本試劑盒的光信號(hào)可以通過(guò)化學(xué)發(fā)光儀、酶標(biāo)儀或液閃測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定。該試劑盒具有檢測(cè)迅速、靈敏度高、檢測(cè)范圍廣,無(wú)細(xì)胞內(nèi)源活性干擾等特點(diǎn)。

Figure 1. Bioluminescent reactions catalyzed by firefly luciferase??and Renilla luciferase.

試劑盒組份:

Cat No

Product Name

Size

Price

FBK001

Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit

100T

856

Cat No

Components

Quantity

Storage

FBK001-A

1X Passive Luciferase Lysis Buffer

10ml

-20°C Protect from light??1 year

FBK001-B

Firefly Luciferase Assay Buffer

10ml

-20°C Protect from light??1 year

FBK001-C

D-Luciferin

2mg

-80°C Protect from light??1 year

FBK001-D

Renilla Luciferase Assay Buffer

10mL

-20°C Protect from light??1 year

FBK001-E

Coelenterazine

400ug

-80°C Protect from light??1 year

保存條件:

最好在-80℃保存。將?C?組分溶解到?B?組分后,該混合液不可反復(fù)凍融,建議進(jìn)行小批量分裝,并于-20℃(最長(zhǎng)可儲(chǔ)存?1?個(gè)月)或-80℃(最長(zhǎng)可儲(chǔ)存?1?年)條件下儲(chǔ)存。Renilla Luciferase Assay solution(D+E)應(yīng)新鮮配制,當(dāng)天使用。

使用方法:

1. 裂解細(xì)胞:

將報(bào)告基因細(xì)胞裂解液充分混勻后,按如下方式加入報(bào)告基因細(xì)胞裂解液,充分裂解細(xì)胞。

1.1)對(duì)于貼壁細(xì)胞:吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液后,參考下表加入適量的報(bào)告基因細(xì)胞裂解液;對(duì)于懸浮細(xì)胞:離心去上清后,參考下表加入適量報(bào)告基因細(xì)胞裂解液。

Cell Culture Plate

96-well?plates

48-well?plates

24-well?plates

12-well?plates

6-well?plates

Lysis Buffer?(A) uL/per well

20uL

65uL

100uL

250uL

500uL

注:裂解產(chǎn)物可室溫保存 6 h,-70℃可長(zhǎng)期存放(裂解產(chǎn)物不能反復(fù)凍融);

注:如果螢光素酶的表達(dá)水平比較低,可以嘗試使用更少的裂解液,例如6孔板的每孔用量可以最小為100微升。
      1.2)?充分裂解后,10,000-15,000g離心3-5分鐘,取上清用于測(cè)定。
注:細(xì)胞裂解后可以立即測(cè)定螢光素酶,也可以先凍存,待以后再測(cè)定。凍存樣品需融解,并達(dá)到室溫后再進(jìn)行測(cè)定。

2. Preparation of Firefly Working Solution

2.1)?將所有組分恢復(fù)至室溫。

2.2)?配置10 mg/mL D-luciferin儲(chǔ)存液。2mg組份C溶解在200uL超純水中。儲(chǔ)存液-20℃可以?xún)?chǔ)存6個(gè)月反復(fù)凍融5次。

2.3)工作液配置 :用組分?B?按照1:50稀釋以上D-luciferin儲(chǔ)存液,配制成?0.2 mg/mL?的螢火蟲(chóng)螢光素酶工作液。

注:螢火蟲(chóng)螢光素酶工作液不能反復(fù)凍融超過(guò)5次,若單次實(shí)驗(yàn)用量較少,建議按單次使用量分裝成小規(guī)格。

3. Preparation of Renilla Working Solution

3.1)??將所有組分恢復(fù)至室溫。

3.2)?配置2 mg/mL Coelenterazine儲(chǔ)存液。400ug組份C溶解在200uL超純水中。儲(chǔ)存液-20℃可以?xún)?chǔ)存3個(gè)月反復(fù)凍融5次。

3.3)工作液配置 :用組分?D?按照1:50稀釋以上coelenterazine儲(chǔ)存液,配制成?0.04 mg/mL?的1x?coelenterazine工作液。

注:1×Coelenterazine工作液現(xiàn)配現(xiàn)用,配置后在3小時(shí)內(nèi)使用。

4. 化學(xué)發(fā)光值檢測(cè)

4.1)按儀器操作說(shuō)明書(shū)開(kāi)啟具有檢測(cè)化學(xué)發(fā)光功能的儀器如酶標(biāo)儀。

4.2)每個(gè)樣品測(cè)定時(shí),取樣品?20-100uL(如果樣品量足夠,請(qǐng)加入?100 μL;如果樣品量不足可適當(dāng)減少用量,但檢測(cè)孔用量需保持一致)。1× Lysis Buffer?為空白對(duì)照。

4.3)加入?100uL螢火蟲(chóng)螢光素酶檢測(cè)液,用槍吹打均勻或用其它適當(dāng)方式混勻后測(cè)定?RLU(relative light unit)值。

注:由于該發(fā)光為瞬時(shí)發(fā)光,建議加入螢火蟲(chóng)螢光素酶工作液后,立即進(jìn)行檢測(cè)。

4.4)加入?100uL 1× Coelenterazine?工作液,用槍吹打均勻或用其它適當(dāng)方式混勻后測(cè)定?RLU(relative light unit)值。

4.5)在以海腎螢光素酶為內(nèi)參的情況下,用螢火蟲(chóng)螢光素酶測(cè)定得到的?RLU?值除以海腎螢光素酶測(cè)定得到的?RLU?值。根據(jù)得到的比值來(lái)比較不同樣品間目的報(bào)告基因的激活程度。如果以螢火蟲(chóng)螢光素酶為內(nèi)參,也可以進(jìn)行類(lèi)似計(jì)算。

注意事項(xiàng):

1)為取得最佳測(cè)定效果,在用單管的化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定時(shí), 樣品和測(cè)定試劑混合后到測(cè)定前的時(shí)間應(yīng)盡量控制一致;使用具有化學(xué)發(fā)光測(cè)定功能的多功能熒光酶標(biāo)儀時(shí),宜先把樣品全部加好,然后統(tǒng)一加入螢火蟲(chóng)螢光素酶檢測(cè)試劑。

2)?由于溫度對(duì)酶反應(yīng)有影響,所以測(cè)定時(shí),樣品和試劑均需達(dá)到室溫后再進(jìn)行測(cè)定。

3?本公司所有產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員用于生命科學(xué)研究,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅。

4)?本公司所有產(chǎn)品必須由合格專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員操作同時(shí)佩戴口罩/手套/實(shí)驗(yàn)服并遵守生物實(shí)驗(yàn)室安全操作規(guī)程!