正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義：

POD（EC 1.11.1.7）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，可催化過(guò)氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過(guò)氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。

測(cè)定原理：

POD催化H₂O₂氧化特定底物，在470nm有特征光吸收。

組成：

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟和加樣表：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至470nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 工作液的配制：臨用前將試劑一、試劑二、試劑三按照2.6（ml）：1.5（μl）：1（μl）的比例混勻；在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）預(yù)熱10min以上；現(xiàn)配現(xiàn)用。

3、 在1ml玻璃比色皿中加入50μl樣本和950μl工作液，混勻，記錄470nm下1min時(shí)吸光值A1和2min后的吸光值A2。計(jì)算ΔA＝A2-A1。

注意：

如果ΔA小于0.005，可將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到5min。如果ΔA大于0.5，可將樣本用提取液稀釋后測(cè)定，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

POD活性計(jì)算：

1、血清（漿）POD活性

單位定義：每ml血清（漿）在每ml反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

計(jì)算公式：

POD（U/ml）=ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T =2000×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞POD活性

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白在每ml反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

POD（U/mg prot）＝ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T =2000×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織在每ml反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

POD（U/g 鮮重）＝ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =2000×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每ml反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

POD（U/10⁴ cell）＝ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T =4×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1ml； V樣：加入樣本體積，0.05ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。