正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義：

H₂O₂是生物體內(nèi)最常見(jiàn)的活性氧分子，主要由SOD和XOD等催化產(chǎn)生，由CAT和POD等催化降解。H₂O₂不僅是重要的活性氧之一，也是活性氧相互轉(zhuǎn)化的樞紐。一方面，H₂O₂可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸，蛋白質(zhì)等生物大分子，并使細(xì)胞膜遭受損害，從而加速細(xì)胞的衰老和解體；另一方面H₂O₂也是許多氧化應(yīng)急反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

測(cè)定原理：

H₂O₂與硫酸鈦生成黃色的過(guò)氧化鈦復(fù)合物，在415nm有特征吸收。

試劑的組成和配制：

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入3ml濃鹽酸充分溶解備用。用不完的試劑4℃保存；(溶解時(shí)間較長(zhǎng)，約30min，可40℃-60℃加熱，務(wù)必提前準(zhǔn)備)

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、丙酮100ml、濃鹽酸5ml、研缽和冰。

H₂O₂提取：

1、細(xì)菌或細(xì)胞樣品的制備：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；用試劑一定容至1ml；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2. 組織樣品的制備：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿；轉(zhuǎn)移至EP管中，用試劑一定容至1ml，8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至415nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 將試劑二、三和四37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。

3、 在EP管中按順序加入下列試劑。

充分混勻，靜置5min后，20000g，25℃離心5min，棄上清，沉淀中加入：

加入試劑四溶解沉淀后，室溫靜置5min，取200μL轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或96孔板中測(cè)定415nm處吸光值A。對(duì)照管只要做一次即可。計(jì)算ΔA＝A測(cè)定-A對(duì)照。

注意事項(xiàng)

1、由于試劑一易揮發(fā)，試劑一必須先預(yù)冷再加，研磨時(shí)必須在冰上研磨。

2、本試劑盒中試劑的揮發(fā)性較高，請(qǐng)帶一次性手套和口罩。

H₂O₂含量計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸曲線，y = 0.7488x + 0.0006 (x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μmol/ml；y為ΔA)。

2、血清（漿）中H₂O₂含量的計(jì)算：

H₂O₂含量（μmol/ml）＝(ΔA-0.0006) ÷0.7488=1.34×(ΔA-0.0006)

3、細(xì)菌、細(xì)胞或動(dòng)物組織中H₂O₂含量計(jì)算

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

H₂O₂含量(μmol/mg prot)=[ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(V1×Cpr)= 1.34×(ΔA-0.0006)÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

H₂O₂含量(μmol/g鮮重)=[ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(W ×V1÷V2)= 1.34×(ΔA-0.0006)÷W

 (3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

H₂O₂含量(μmol/10⁴)=[ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0027×(ΔA-0.0006)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.25ml；V2：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸曲線，y = 0.3744x + 0.0006  (x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μmol/ml；y為ΔA)。

2、血清（漿）中H₂O₂含量的計(jì)算：

H₂O₂含量（μmol/ml）＝(ΔA-0.0006)÷0.3744=2.67×(ΔA-0.0006)

3、細(xì)菌、細(xì)胞或組織中H₂O₂含量計(jì)算

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

H₂O₂含量(μmol/mg prot)=[(ΔA-0.0006) ÷0.3744×V1]÷(V1×Cpr)=2.67×(ΔA-0.0006) ÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

H₂O₂含量(μmol/g鮮重)=[(ΔA-0.0006) ÷0.3744×V1]÷(W ×V1÷V2)= 2.67×(ΔA-0.0006) ÷W

 (3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

H₂O₂含量(μmol/10⁴)=[(ΔA-0.0006) ÷0.3744×V1]÷(500×V1÷V2)= 0.0054×(ΔA-0.0006)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.25ml；V2：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。

注意：標(biāo)曲線性范圍為0.1μmol/ml-2μmol/ml，吸光度ΔA線性范圍為0.03-1，若ΔA超過(guò)1則需要稀釋，計(jì)算公式乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。