正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義：

氧自由基作用于脂質(zhì)的不飽和脂肪酸，生成過(guò)氧化脂質(zhì)；后者逐漸分解為一系列復(fù)雜的化合物，其中包括MDA。通過(guò)檢測(cè)MDA的水平即可檢測(cè)脂質(zhì)氧化的水平。

測(cè)定原理：

MDA與硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)縮合，生成紅色產(chǎn)物，在532nm有最大吸收峰，進(jìn)行比色后可估測(cè)樣品中過(guò)氧化脂質(zhì)的含量；同時(shí)測(cè)定600nm下的吸光度，利用532nm與600nm下的吸光度的差值計(jì)算MDA的含量。

試劑的組成和配置：

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

注意事項(xiàng)

臨用前注意試劑一是否完全溶解，如未溶解，可以70℃-90℃加熱，并振蕩以促進(jìn)溶解。

MDA提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

2、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

4、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、吸取0.3ml 試劑一于1.5ml離心管中，再加入0.1ml樣本, 混勻。

2、95℃水浴中保溫30min（蓋緊，防止水分散失），置于冰浴中冷卻，10000g，25℃，離心10min。

3、吸取200μl上清液于微量石英比色皿或96孔板中，測(cè)定532nm和600nm處的吸光度，記為A532和A600，ΔA= A532-A600。

MDA含量計(jì)算：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）中MDA含量的計(jì)算：

MDA含量(nmol/ ml)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷V樣=25.8×ΔA

2、細(xì)菌、細(xì)胞或動(dòng)物組織中MDA含量計(jì)算

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

MDA含量(nmol/ mg prot)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V樣)=25.8× ΔA ÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2）按照樣品質(zhì)量計(jì)算

MDA含量(nmol/g 鮮重)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)=25.8×ΔA ÷W

 (3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

MDA含量(nmol/10⁴)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)=0.0516×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積， 4×10^-4 L；ε：丙二醛摩爾消光系數(shù)，155×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）中MDA含量的計(jì)算：

MDA含量(nmol/ ml)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷V樣=51.6×ΔA

2、細(xì)菌、細(xì)胞或動(dòng)物組織中MDA含量計(jì)算

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

MDA含量(nmol/ mg prot)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V樣)=51.6×ΔA÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2）按照樣品質(zhì)量計(jì)算

MDA含量(nmol/g 鮮重)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)=51.6×ΔA÷W

 (3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

MDA含量(nmol/10⁴)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)=0.1032×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，4×10^-4 L；ε：丙二醛摩爾消光系數(shù)，155×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.1 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。