正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義：

活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括超氧自由基、過(guò)氧化氫、及其下游產(chǎn)物過(guò)氧化物和羥化物等，研究表明，機(jī)體95％以上的活性氧（ROS）都來(lái)自于線粒體，其失衡所致的氧化應(yīng)激與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過(guò)程有關(guān)。

正常情況下，細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)與氧自由基處于平衡狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平維持在較低的生理范圍；在病理情況下，細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)與氧自由基的平衡被打破，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平過(guò)多，就可破壞線粒體酶類(lèi)、脂類(lèi)和核酸，使機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激，同時(shí)，活性氧還可攻擊線粒體DNA產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致線粒體ATP合成減少、線粒體膜電位破壞等結(jié)構(gòu)和功能變化。

因此，通過(guò)檢測(cè)活性氧的變化來(lái)判斷線粒體的功能是否正常具有重要意義。

測(cè)定原理：

熒光探針-還原型二氯熒光素 (2', 7'-dichlorodihy drofluorescin diacetate, DCFH-DA)可擴(kuò)散通過(guò)線粒體膜，在線粒體內(nèi)被酯酶水解，形成無(wú)熒光的DCFH，DCFH迅速與ROS反應(yīng)生成熒光物—氧化型二氯熒光素(2', 7'-dichlo rofluorescin, DCF)。 根據(jù)上述原理設(shè)計(jì)了利用熒光法直接定量檢測(cè)線粒體ROS產(chǎn)生速率的方法。將熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合，線性回歸直線斜率與ROS產(chǎn)生的速率呈正比。

組成：

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入6 ml試劑二充分溶解；

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入6 ml試劑二充分溶解；

試劑六：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入6 ml試劑二充分溶解；

試劑七：液體×1瓶, -20℃避光保存；臨用前用試劑二稀釋300倍后使用；

自備儀器和用品：

多功能酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、冰、蒸餾水。

線粒體提取：

1、準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1ml試劑一和10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將上述勻漿液于600g（離心率），4℃離心5min。

3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

4、棄上清，沉淀中加入200μl試劑二重懸。

測(cè)定步驟：

1、 多功能酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)激發(fā)光499nm，發(fā)射光521nm。

2. 在黑色不透光96孔板中加入下列試劑

孵育完成后，在37℃恒溫下測(cè)定10min內(nèi)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)499nm，發(fā)射波長(zhǎng)521nm，記錄10min內(nèi)的熒光值變化。

ROS產(chǎn)生速率計(jì)算：

對(duì)采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)即熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化進(jìn)行線性回歸擬合處理 ,計(jì)算出回歸系數(shù),即直線斜率（k）。實(shí)際線粒體ROS產(chǎn)生速率等于樣本熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的數(shù)據(jù)點(diǎn)線性回歸直線斜率(k測(cè)定)減去本底熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變的數(shù)據(jù)點(diǎn)線性回歸直線斜率（k空白）。

(1)按樣本鮮重計(jì)算：每g組織線粒體每秒鐘熒光單位的變化,即u/ s/g 鮮重    

ROS產(chǎn)生速率(u/ s/g鮮重)=(k測(cè)定-k空白)/(V樣÷V總×W）=10×(k測(cè)定-k空白)÷W

(2)按樣本蛋白濃度計(jì)算：每毫克蛋白線粒體每秒鐘熒光單位的變化u/ s/mg prot。

ROS產(chǎn)生速率(u/ s/ mg prot)=(k測(cè)定-k空白)/(V樣÷V總×Cpr）=10×(k測(cè)定-k空白)÷Cpr

V樣：加入樣本體積，0.02 ml；V樣總：懸液體積，0.2 ml；W: 樣本鮮重，g；Cpr: 樣本蛋白濃度，mg/ml。