測(cè)定意義：

CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，是三羧酸循環(huán)第一個(gè)限速酶，是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點(diǎn)之一。

測(cè)定原理：

CS催化乙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔酶A，進(jìn)一步水解產(chǎn)生檸檬酸；該反應(yīng)促使無色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB，在 412nm處有特征吸光值。

組成：

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存，臨用前加入1.2ml蒸餾水，用不完的試劑仍-20℃保存；

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

① 稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1ml試劑一和10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿600g，4℃離心5min。

③ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

④ 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的CS（此步可選做）。

⑤ 在步驟④的沉淀中加入200μl試劑二和2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體CS測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至412nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

（1）在試劑五中加入0.6ml無水乙醇和13ml試劑四，混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

（2）測(cè)定管：在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl樣本、220μl試劑五和10μl試劑六，混勻，37℃反應(yīng)15min后立即測(cè)定吸光值A1。

（3）對(duì)照管：在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl樣本、220μl試劑四和10μl試劑六，混勻，37℃反應(yīng)15min后立即測(cè)定吸光值A2。

（4）計(jì)算ΔA=A1-A2，每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

CS活性計(jì)算：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=117.6×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T=23.8×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.0475×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2.4×10^-4 L；ε：TNB摩爾消光系數(shù)，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，15 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。

b. 使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=235.3×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T=47.5×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.095×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2.4×10^-4 L；ε：TNB摩爾消光系數(shù)，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，15 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。