測(cè)定意義：

乙醇俗稱酒精，是最常見的一元醇，在檢測(cè)酒的質(zhì)量、分析血液乙醇含量和果蔬品質(zhì)判斷中通常需要頻繁、大量地檢測(cè)乙醇含量。

1.乙醇是酒的主要成分，是衡量酒質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。我國(guó)是世界上最早發(fā)明釀酒的國(guó)家，也是酒類產(chǎn)品消費(fèi)大國(guó)，其消費(fèi)量居世界之首。因此，快速、準(zhǔn)確測(cè)定酒中乙醇含量，對(duì)于確保酒的質(zhì)量和保護(hù)消費(fèi)者的健康具有重大意義。

2.乙醇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最基本的抑制物，如果乙醇被大量攝入，會(huì)不可逆抑制呼吸甚至導(dǎo)致死亡，血液中乙醇檢測(cè)結(jié)果通常作為認(rèn)定是否酒后駕駛或醉酒駕駛的依據(jù)。

3.乙醇是判斷儲(chǔ)藏過程中果蔬品質(zhì)變化的重要指標(biāo)，研究表明，適當(dāng)?shù)囊掖继幚砟軌驕p少腐爛和減輕果蔬生理病害、延緩果蔬成熟和衰老進(jìn)程，從而延長(zhǎng)貨架壽命。因此，簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和快速測(cè)定果蔬中乙醇含量具有非常重要的意義。

測(cè)定原理：

乙醇在乙醇脫氫酶的催化下氧化脫氫生成乙醛，同時(shí)，NAD被還原生成NADH，NADH在1-mPMS的作用下使WST-8顯橙黃色，通過450 nm下測(cè)定吸光值變化可測(cè)得乙醇含量。

組成：

試劑二：粉劑×1瓶, -20℃保存；臨用前加入6 ml試劑三充分溶解待用，用不完的試劑分裝后-20℃保存；

自備儀器和用品：

酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰、蒸餾水。

乙醇提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：蒸餾水體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml蒸餾水），進(jìn)行勻漿，8000g，25℃離心10min，取上清待測(cè)。

2. 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：蒸餾水體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml蒸餾水），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）， 8000g，25℃離心10min，取上清待測(cè)。

3. 血清（漿）等液體樣品：直接測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至450nm。

2. 工作液的配制：臨用前按照樣本數(shù)量，按以下比例配制工作液

3. 樣本測(cè)定

按下表在96孔板中加入如下試劑

混勻后記錄450nm下測(cè)定初始吸光值A1，和37℃避光孵育10min后的吸光值A2，計(jì)算

△A=A2-A1。

乙醇含量計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0256x + 0.0055          R² = 0.9991；

x為乙醇含量（μmol/ml），y為吸光值差值△A。

1. 按照血清（漿）體積計(jì)算

乙醇含量（μmol/ml）= (△A-0.0055)÷0.0256

=39.1×(△A-0.0055)

2. 按照樣品質(zhì)量計(jì)算

乙醇含量（μmol/g鮮重）= [ (△A-0.0055)÷0.0256×V1]÷(W ×V1÷V2）

= 39.1×(△A-0.0055)÷W

3. 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

乙醇含量（μmol/10⁴ cell）= [ (△A-0.0055)÷0.0256×V1]÷（500×V1÷V2）

=0.078×(△A-0.0055)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.04ml；V2：加入提取液體積，1 ml； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬；

注意事項(xiàng)：

測(cè)定前取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，若△A﹥0.3或乙醇含量﹥10μmol/ml，需將樣本用蒸餾水稀釋后再測(cè)定，以確保測(cè)定的準(zhǔn)確性。

最低檢測(cè)限：0.02μmol/ml。