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NADP磷酸酶（NADPase）檢測(cè)試劑盒（微量法 100T/96S）
| 貨號(hào) | SH0116 | 售價(jià)（元） | 1320 |
| 規(guī)格 | 100T/96S | CAS號(hào) |
- 產(chǎn)品簡(jiǎn)介
- 相關(guān)產(chǎn)品
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貨號(hào) |
名稱 |
規(guī)格 |
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SH0116 |
NADP磷酸酶（NADPase）檢測(cè)試劑盒（微量法 100T/96S） |
100管/96樣 |
測(cè)定意義：
NADPase主要存在于植物組織中，是生物體內(nèi)唯一催化NADP+降解為NAD+的酶，與NADK一起調(diào)控NAD和NADP之間的平衡。
測(cè)定原理：
NADPase能夠催化NADP+水解為NAD+和無(wú)機(jī)磷的反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷的量來(lái)測(cè)定NADPase活性。
組成：
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產(chǎn)品名稱 |
SH0116-100T/96S |
Storage |
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提取液： |
100ml |
4℃ |
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試劑一：液體 |
15ml |
4℃ |
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試劑二：粉劑 |
1瓶×4 |
-20℃ |
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試劑三：粉劑 |
1瓶 |
4℃ |
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試劑四：粉劑 |
1瓶 |
4℃ |
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試劑五：液體 |
25ml |
RT |
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試劑六：10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 |
10ml |
4℃ |
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說(shuō)明書(shū) |
一份 |
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試劑二：粉劑×4支，-20℃保存；用時(shí)加入1 ml試劑一充分溶解備用，現(xiàn)配現(xiàn)用。
試劑三：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25ml蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。
試劑四：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25ml蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。
試劑六：10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10ml×1 瓶，4℃保存。
0.5μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將試劑六20倍稀釋，即取 0.5ml試劑六加9.5蒸餾水，充分混勻。
定磷試劑的配制：按H2O: 試劑三:試劑四:試劑五=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色，若無(wú)色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
自備儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水
樣本的前處理：
按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至660nm，蒸餾水調(diào)零。
2、酶促反應(yīng)（在EP管中加入下列試劑）
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試劑名稱（μl） |
測(cè)定管 |
對(duì)照管 |
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試劑一 |
120 |
120 |
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試劑二 |
40 |
40 |
37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）預(yù)熱5min
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樣本 |
40 |
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蒸餾水 |
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40 |
37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）準(zhǔn)確反應(yīng)30min后，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，10000g 25℃離心5min，取上清
3、定磷（在EP管或96孔板中加入下列試劑）
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標(biāo)準(zhǔn)管 |
空白管 |
測(cè)定管 |
對(duì)照管 |
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0.5μmol/ml標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液 |
20 |
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蒸餾水 |
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20 |
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上清液 |
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20 |
20 |
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定磷試劑 |
200 |
200 |
200 |
200 |
混勻，25℃室溫放置30min，在 660nm處，記錄各管吸光值。
注意事項(xiàng)：
1、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測(cè)定所用試管要求嚴(yán)格，要沒(méi)有一點(diǎn)磷，若試管放過(guò)磷酸或磷酸鹽緩沖液，一定要洗得非常干凈，要先用洗潔精加水煮，再用自來(lái)水沖，最后用蒸餾水沖干凈。最好用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是檢測(cè)成敗的關(guān)鍵。
2、標(biāo)準(zhǔn)管、空白管和對(duì)照管只要做一次即可。
NADPase酶活性計(jì)算：
1、按組織蛋白濃度計(jì)算：
定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白NADPase分解NADP 產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè) NADPase活力單位。
NADPase (μmol/h/mg prot)=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷
(V樣×Cpr)÷T=5×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr
2、按樣本鮮重計(jì)算：
定義：每小時(shí)每g組織NADPase分解NADP 產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè) NADPase活力單位。
NADPase (μmol/h /g鮮重)=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×V總÷(W× V樣÷V樣總)÷T=5×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W
C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/ml；V總：酶促反應(yīng)總體積，0.2ml；V樣：加入樣本體積，0.04ml ；V樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5小時(shí)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本鮮重，g。