正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                           

測(cè)定意義：

脯氨酸是植物體內(nèi)適應(yīng)逆境脅迫的一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。高等植物中脯氨酸代謝因其初始底物不同，分為谷氨酸( Glu) 和鳥氨酸( Orn) 兩條合成途徑。

吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS，Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase）是以谷氨酸為前體合成脯氨酸途徑的關(guān)鍵酶，對(duì)植物適應(yīng)逆境脅迫起關(guān)鍵作用。

測(cè)定原理：

吡咯啉-5-羧酸合成酶催化谷氨酸生成P5C過程中分解ATP生成ADP和無機(jī)磷，通過鉬酸銨比色法測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生無機(jī)磷的量可確定P5CS活性。

組成：

試劑四用時(shí)加入25 ml蒸餾水，溶解后4℃保存一周；

試劑五用時(shí)加入25 ml蒸餾水，溶解后4℃保存一周；

0.5μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：

將試劑七 20倍稀釋，即取 0.1ml試劑七加1.9ml蒸餾水充分混勻。

定磷劑的配制：

按H2O: 試劑四:試劑五:試劑六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

自備儀器和用品：

可見外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣品酶液的制備：

1、組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

操作步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至660nm。

2、酶促反應(yīng)（在EP管中加入下列試劑）

混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其他物種）準(zhǔn)確水浴10min

混勻，8000g，25℃離心10min，取上清液

3、定磷（在EP管或96孔板中加入下列試劑）

混勻，室溫放置30min，在 660nm處，記錄各管吸光值。

注意：

1、由于每一個(gè)樣都必須做對(duì)照，本試劑盒50管保證測(cè) 24份P5CS活性。

2、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測(cè)定所用試管要求嚴(yán)格無磷。

3、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

計(jì)算

1、血清（漿）P5CS活力的計(jì)算:

單位定義：每小時(shí)每毫升血清（漿）中P5CS 消耗ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

P5CS活力（μmol/h/ml）=C標(biāo)準(zhǔn)管×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×V總÷V樣÷T=9 ×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）

2、組織中P5CS活力的計(jì)算：

（1）按蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白中P5CS消耗ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

P5CS活力(μmol/h /mg prot)=C標(biāo)準(zhǔn)管×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×V總÷（Cpr×V樣）÷T =9 ×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每小時(shí)每克組織中P5CS消耗ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

P5CS活力(μmol/h /g 鮮重)=C標(biāo)準(zhǔn)管×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×V總÷(W× V樣÷V樣總)÷T=9 ×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷W

C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/ml；V總：酶促反應(yīng)總體積，0.3ml；V樣：加入樣本體積，0.1ml ；V樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1/6小時(shí)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本鮮重，g。