測(cè)定意義：

幾丁質(zhì)主要存在于蝦、蟹、昆蟲(chóng)等甲殼類(lèi)動(dòng)物的外殼與軟體動(dòng)物的器官(例如烏賊的軟骨)，以及真菌類(lèi)的細(xì)胞壁中。而幾丁質(zhì)酶(EC 3.2.1.14)可催化幾丁質(zhì)水解，具有抵御真菌侵染的作用，成為抗真菌病害的研究熱點(diǎn)。

測(cè)定原理：

幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生N-乙酰氨基葡萄糖，進(jìn)一步與對(duì)二甲氨基苯甲醛產(chǎn)生紅色化合物，在585nm處有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了幾丁質(zhì)酶的活性。

組成：

試劑二：液體5ml×1瓶，4℃保存。（若出現(xiàn)結(jié)晶，可80℃左右加熱溶解后使用）

自備儀器和用品：

天平、水浴鍋、離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、甲苯（土壤樣品專(zhuān)用）和蒸餾水。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測(cè)。

2. 真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1ml提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心20min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 培養(yǎng)液：直接測(cè)定。

測(cè)定操作表：

計(jì)算公式：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.3088-0.003，R²=0.9995

計(jì)算公式：

按照樣本重量計(jì)算

酶活性定義：37℃條件下，每克組織每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活性單位。

幾丁質(zhì)酶活性（mg/h/g鮮重）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反總÷(V樣÷V樣總×W) ÷T

=8.096×（ΔA +0.003）÷W

按照蛋白質(zhì)濃度計(jì)算

酶活定義：37℃條件下，每毫克蛋白每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活單位。

幾丁質(zhì)酶活性（mg/h mg prot）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T           

= 8.096×（ΔA +0.003）÷Cpr

按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：37℃條件下，每10⁴個(gè)細(xì)胞每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活單位。

幾丁質(zhì)酶活性（mg/h /10⁴ cell）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反總÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)

=8.096×（ΔA +0.003）÷細(xì)胞數(shù)量

4、按液體體積計(jì)算

酶活定義：37℃條件下，每毫升培養(yǎng)液每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活單位。

幾丁質(zhì)酶活性（mg/h /ml）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反總÷V樣=8.096×（ΔA +0.003）

V反總：反應(yīng)體系總體積，1ml；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.4ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml

b. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.1544x-0.003，R²=0.9995

計(jì)算公式：

按照樣本重量計(jì)算

酶活性定義：37℃條件下，每克組織每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活性單位。

幾丁質(zhì)酶活性（mg/h/g鮮重）=（ΔA+0.003）÷0.1544×V反總÷(V樣÷V樣總×W) ÷T

=16.192×（ΔA +0.003）÷W

按照蛋白質(zhì)濃度計(jì)算

酶活定義：37℃條件下，每毫克蛋白每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活單位。

幾丁質(zhì)酶活性（mg/h mg prot）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T           

= 16.192×（ΔA +0.003）÷Cpr

按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：37℃條件下，每10⁴個(gè)細(xì)胞每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活單位。

幾丁質(zhì)酶活性（mg/h /10⁴ cell）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反總÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)

=16.192×（ΔA +0.003）÷細(xì)胞數(shù)量

4、按液體體積計(jì)算

酶活定義：37℃條件下，每毫升培養(yǎng)液每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活單位。

幾丁質(zhì)酶活性（mg/h /ml）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反總÷V樣=16.192×（ΔA +0.003）

V反總：反應(yīng)體系總體積，1ml；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.4ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml

注意事項(xiàng)：

1、 反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)行比色。

2、 試劑四有一定的毒性，請(qǐng)操作時(shí)做好防護(hù)措施。