測(cè)定意義：

糖化酶，即葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），又稱γ-淀粉酶，是一種外切型糖苷酶，它從淀粉的非還原性末端水解α-1,4糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵，將淀粉完全水解為葡萄糖，因此廣泛的應(yīng)用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有機(jī)酸，甘油，淀粉糖等工業(yè)中，是我國(guó)重要的工業(yè)酶制劑之一。

測(cè)定原理：

糖化酶水解可溶性淀粉生成葡萄糖，與3,5-二硝基水楊酸生成紅棕色化合物，在540nm處有最大光吸收，在一定范圍內(nèi)反應(yīng)液顏色深淺與葡萄糖的量成正比，可測(cè)定計(jì)算得糖化酶的活力。

組成：

自備儀器和用品：

天平、低溫離心機(jī)、研缽、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。

酶液提?。?/span>

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1ml提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1ml提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作：

酶活性計(jì)算公式：

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.2164x - 0.0182，R² = 0.9992

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1. 按照蛋白含量計(jì)算

酶活性定義：在40℃，pH4.6條件下，每毫克蛋白每分鐘分解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

糖化酶活性（U/mg prot）=（△A+0.0182）÷ 0.2164×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

                        = 2.54×（△A+0.0182）÷ Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在40℃，pH4.6條件下，每克組織每分鐘分解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

糖化酶活性（U/g）=（△A+0.0182）÷ 0.2164×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T

= 2.54×（△A+0.0182）÷ W

3. 按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：在40℃，pH4.6條件下，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

糖化酶活性（U/ml）=（△A+0.0182）÷ 0.2164×V反總÷V樣÷T

                  = 2.54×（△A+0.0182）

4. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：在40℃，pH4.6條件下，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘分解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

糖化酶活性（U/10⁴cell）=（△A+0.0182）÷ 0.2164×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）÷V樣總）÷T

                      = 2.54×（△A+0.0182）÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

V反總：反應(yīng)總體積，0.11ml，V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.01ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，20min

b. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.1082x - 0.0182，R² = 0.9992

1. 按照蛋白含量計(jì)算

酶活性定義：在40℃，pH4.6條件下，每毫克蛋白每分鐘分解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

糖化酶活性（U/mg prot）=（△A+0.0182）÷ 0.1082×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

                        = 5.08×（△A+0.0182）÷ Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在40℃，pH4.6條件下，每克組織每分鐘分解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

糖化酶活性（U/g）=（△A+0.0182）÷ 0.1082×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T

= 5.08×（△A+0.0182）÷ W

3. 按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：在40℃，pH4.6條件下，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

糖化酶活性（U/ml）=（△A+0.0182）÷ 0.1082×V反總÷V樣÷T

                  = 5.08×（△A+0.0182）

4. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：在40℃，pH4.6條件下，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘分解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

糖化酶活性（U/10⁴cell）=（△A+0.0182）÷ 0.1082×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）÷V樣總）÷T

                      = 5.08×（△A+0.0182）÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

V反總：反應(yīng)總體積，0.11ml，V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.01ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，20min

注意事項(xiàng)：

1. 滅活樣本的制備建議將樣本放在沸水浴中煮沸10min，以將酶徹底滅活。

2. 測(cè)定之前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，若吸光值較高，請(qǐng)將樣品用提取液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂屧贉y(cè)定，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。