測定意義：

PEPC（EC 4.1.1.31）廣泛存在于動物、植物、微生物和細(xì)胞中，是催化磷酸烯醇式丙酮酸與二氧化碳反應(yīng)生成草酰乙酸呈不可逆反應(yīng)的酶，對三羧酸循環(huán)的運(yùn)轉(zhuǎn)起重要調(diào)節(jié)作用。

測定原理：

PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和CO₂生成草酰乙酸和HPO4^2-，蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD⁺，在340nm測定NADH減少速率，計(jì)算PEPC活性。

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑五工作液的配制：將試劑五原液：試劑五稀釋液=1μl:329μl稀釋，用多少配多少。

3、 將試劑一、二、三、四和試劑五工作液置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預(yù)熱5分鐘。

加樣表：

將上述試劑按順序加入1 ml石英比色皿中，立即混勻，加樣本的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，340 nm波長下記錄初始吸光度A1和反應(yīng)5分鐘后的吸光度A2。計(jì)算ΔA=A1-A2。

注意事項(xiàng)：如果一次性測定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三、四、和試劑五工作液按比例配成混合液。

PEPC活性計(jì)算：

1、血清（漿）PEPC活力計(jì)算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPC（nmol/min/ml））＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=1624×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PEPC活力計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1624×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPC（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=1624×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每1萬個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPC（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=3.248×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1.010×10^-3 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。