測(cè)定意義：

HK（EC 2.7.1.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是葡萄糖分解過(guò)程中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途徑的交叉點(diǎn)。

測(cè)定原理：

HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步催化6-磷酸葡萄糖脫氫生成NADPH，NADPH在340nm有特征吸收峰。

組成：

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入30ml蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：粉劑×1支，-20℃保存，臨用前加入4ml蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑五：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入2ml蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入250μl試劑一和250μl蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 將試劑一、二、三、四和五37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)預(yù)熱10分鐘。

3、 加樣表：

將上述試劑按順序加入1 ml石英比色皿中，立即混勻，加樣本的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，在340 nm波長(zhǎng)下記錄20秒時(shí)的初始吸光度A1和5分20秒時(shí)的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

注意事項(xiàng)：

1、為了減小操作誤差，建議將試劑一、二、三、四、五按比例配成混合液，預(yù)熱10min，取30μl樣本+8μl試劑六+1ml混合液，混勻后按照上述步驟檢測(cè)。

2、不同勻漿組織中HK活力不一樣，做正式試驗(yàn)之前請(qǐng)做1-2只預(yù)試，若ΔA>0.5，則說(shuō)明組織活力太高，必須用提取液稀釋成適當(dāng)濃度勻漿上清液（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），或縮短反應(yīng)時(shí)間至2min,使ΔA<0.5，以提高檢測(cè)靈敏度。

HK活性計(jì)算：

1、血清（漿）HK活性

單位的定義：每毫升血清（漿）在每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=1113×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中HK活性

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1113×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=1113×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=2.226×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1.038×10^-3 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.03 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。