正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定                                             

測定意義：

PFK（EC 2.7.1.11）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，負(fù)責(zé)將果糖-6-磷酸和ATP轉(zhuǎn)化為果糖-1,6二磷酸和ADP，是糖酵解過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶之一。

測定原理：

PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADH氧化生成NAD⁺，在340nm下測定NADH下降速率，即可反映PFK活性。組成：

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存，臨用前加入2.8ml蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20度保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑三：粉劑×1支，4℃保存，臨用前加入260μl蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20度保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑四：液體16μl×1支，4℃保存，臨用前加入260μl蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20度保存，禁止反復(fù)凍融；

自備儀器和用品：

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（ml）為1000~5000：1的比例（建議2000萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟和加樣表：

1、 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液（可測25個樣）的配制：取19ml試劑一和1.26ml試劑二充分混勻；用不完的試劑分裝后-20度保存，禁止反復(fù)凍融；

3、將工作液置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預(yù)熱10分鐘。

4、加樣表：

將上述試劑按順序加入1 ml石英比色皿中，立即混勻，加試劑四的同時開始計時，記錄在340 nm波長下20秒時的初始吸光度A1和10分20秒時的吸光度A2，計算ΔA=A1-A2。

注意：不同勻漿組織中PFK活力不一樣，做正式試驗之前請做1-2只預(yù)試，若ΔA>0.5，則說明活力太高，必須用提取液稀釋成適當(dāng)濃度勻漿上清液（計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），或縮短反應(yīng)時間至2min或5min，使ΔA<0.5，以提高檢測靈敏度。

PFK活力單位的計算：

1、血清（漿）PFK活力的計算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=450×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PFK活力計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=450×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=450×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(2000×V樣÷V樣總)÷T=0.225×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，8.4×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.03 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，2000萬。