丙酮酸脫氫酶(PDH)檢測試劑盒(微量法100T/96S)
貨號 | SH0233 | 售價(元) | 1740 |
規(guī)格 | 100T/96S | CAS號 |
- 產品簡介
- 相關產品
貨號 |
名稱 |
規(guī)格 |
SH0233 |
丙酮酸脫氫酶(PDH)檢測試劑盒(微量法100T/96S) |
100管/96樣 |
測定意義:
PDH(EC 1.2.4.1)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,是丙酮酸脫氫酶復合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶,催化丙酮酸脫梭生成羥乙基-TPP,把糖酵解和三羧酸循環(huán)連接起來。
測定原理:
PDH催化丙酮酸脫氫,同時還原2,6-二氯酚靛酚(2,6-DCPIP),從而導致600nm光吸收的減少。
組成:
產品名稱 |
SH0233-100T/96S |
Storage |
試劑一:液體 |
100ml |
-20℃ |
試劑二:液體 |
20ml |
-20℃ |
試劑三:液體 |
1.5ml |
-20℃ |
試劑四:液體 |
20ml |
4℃ |
試劑五:粉劑 |
1瓶 |
4℃ |
說明書 |
一份 |
自備儀器和用品:
可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
樣本的前處理:
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
1、 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞,加入1ml試劑一和10μl 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 將勻漿600g,4℃離心5min。
3、 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。
4、 上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的PDH(此步可選做)。
5、 在步驟④的沉淀中加入200μl試劑二和2μl 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復30次),用于線粒體PDH活性測定。
測定步驟:
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節(jié)波長至605nm,蒸餾水調零。
2、 樣本測定
(1)在試劑五中加入19ml試劑四充分溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl樣本和190μl試劑五,混勻,立即記錄605nm處初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2。
PDH活性計算:
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1) 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=952×ΔA÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=192×ΔA÷W
(3) 按細菌或細胞密度計算
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.385×ΔA
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),2.1×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 ml;V樣總:加入提取液體積,0.202 ml;T:反應時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/ml;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
(1) 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1904×ΔA÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=384×ΔA÷W
(3) 按細菌或細胞密度計算
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.77×ΔA
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),2.1×104 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 ml;V樣總:加入提取液體積,0.202 ml;T:反應時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/ml;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。