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丙酮酸脫氫酶(PDH)檢測試劑盒(微量法100T/96S)

貨號 SH0233 售價(元) 1740
規(guī)格 100T/96S CAS號
  • 產品簡介
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貨號

名稱

規(guī)格

SH0233

丙酮酸脫氫酶(PDH)檢測試劑盒(微量法100T/96S)

100管/96樣

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義:

PDHEC 1.2.4.1)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,是丙酮酸脫氫酶復合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶,催化丙酮酸脫梭生成羥乙基-TPP,把糖酵解和三羧酸循環(huán)連接起來。

測定原理:

PDH催化丙酮酸脫氫,同時還原2,6-二氯酚靛酚(2,6-DCPIP),從而導致600nm光吸收的減少。

組成:

產品名稱

SH0233-100T/96S

Storage

試劑一:液體

100ml

-20℃

試劑二:液體

20ml

-20℃

試劑三:液體

1.5ml

-20℃

試劑四:液體

20ml

4℃

試劑五:粉劑

1

4℃

說明書

一份

 

自備儀器和用品:

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理:

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

1、 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞,加入1ml試劑一和10μl 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、 將勻漿600g,4℃離心5min。

3、 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。

4、 上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的PDH(此步可選做)。

5、 在步驟的沉淀中加入200μl試劑二和2μl 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復30次),用于線粒體PDH活性測定。

測定步驟:

1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節(jié)波長至605nm,蒸餾水調零。

2、 樣本測定

1)在試劑五中加入19ml試劑四充分溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;

2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl樣本和190μl試劑五,混勻,立即記錄605nm處初始吸光值A11min后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2。

PDH活性計算:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

 PDH活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=952×ΔA÷Cpr

2) 按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總) ÷T=192×ΔA÷W

3) 按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總)÷T=0.385×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),2.1×104 L / mol /cmd:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 ml;V樣總:加入提取液體積,0.202 ml;T:反應時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mlW:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。

b.96孔板測定的計算公式如下

1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

 PDH活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=1904×ΔA÷Cpr

2) 按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總)÷T=384×ΔA÷W

3) 按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總)÷T=0.77×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 Lε2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),2.1×104 L / mol /cm;d96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 ml;V樣總:加入提取液體積,0.202 ml;T:反應時間,1 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/ml;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。