正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義：

MCS廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，與檸檬酸合酶（CS）共同參與三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)。

測(cè)定原理：

MCS催化丙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生甲基檸檬酰輔酶A，進(jìn)一步水解產(chǎn)生甲基檸檬酸；該反應(yīng)促使無色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB，在 412nm處有特征吸光值。

組成：

SH0243-10T/9S：試劑五：粉劑×1支，4℃保存，臨用前加入320μl無水乙醇；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存，臨用前加入320μl蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑七：粉劑×1支，-20℃保存，臨用前加入320μl蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

① 稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1ml試劑一和10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿600g，4℃離心5min。

③ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

④ 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的CS（此步可選做）。

⑤ 在步驟④中的沉淀中加入200μl試劑二和2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體CS測(cè)定。

SH0242-25T/24S：試劑五：粉劑×1支，4℃保存，臨用前加入800μl無水乙醇；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑六：粉劑×2支，-20℃保存，臨用前加入400μl蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑七：粉劑×1支，-20℃保存，臨用前加入800μl蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

SH0241-50T/48S：試劑五：粉劑×2支，4℃保存，臨用前加入800μl無水乙醇；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑六：粉劑×4支，-20℃保存，臨用前加入400μl蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑七：粉劑×2支，-20℃保存，臨用前加入800μl蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml玻璃比色皿、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

⑥ 稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1ml試劑一和10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

⑦ 將勻漿600g，4℃離心5min。

⑧ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

⑨ 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的CS（此步可選做）。

⑩ 在步驟④中的沉淀中加入200μl試劑二和2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體CS測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至412nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑四、五、六和七在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min。

3、樣本測(cè)定

將上述試劑按順序加入1 ml玻璃比色皿中，加試劑七的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，在412nm波長(zhǎng)下記錄20秒時(shí)的初始吸光度A1和反應(yīng)2min后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

MCS活性計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MCS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1100×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MCS（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T=222.2×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MCS（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.4444×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，9×10^-4 L；ε：TNB摩爾消光系數(shù)，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.03 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。