正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義：

羥甲基戊二酰輔酶A合成酶是甲羥戊酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，催化乙酰CoA與乙酰乙酰CoA生成羥甲基戊二酰CoA。

測(cè)定原理：

HMGCS催化乙酰CoA與乙酰乙酰CoA生成羥甲基戊二酰CoA，同時(shí)產(chǎn)生CoASH，使DTNB轉(zhuǎn)化為黃色的TNB，在412nm下有特征吸光值。

組成：

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃避光保存；臨用前加入7ml蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃避光保存；臨用前加入7ml蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本測(cè)定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至412nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 在1 ml玻璃比色皿中加入125μl試劑一、125μl試劑二和250μl試劑三，混勻，加入500μl樣本上清，迅速混勻后記錄412nm下初始吸光值A1和4min后的吸光值A2。計(jì)算ΔA＝A2-A1。

HMGCS活性計(jì)算：

1、血清（漿）活性

單位定義：每ml血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個(gè)酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /ml）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣 ÷T=36.76×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞HMGCS活性

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個(gè)酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=36.76×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個(gè)酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T=36.76×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個(gè)酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /10⁴ cel）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.074×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；ε：TNB摩爾消光系數(shù)，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.5 ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，4 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。