測定意義：

Na⁺K⁺- ATP酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細(xì)胞中，可催化ATP水解生成ADP和無機磷。

測定原理：

Na⁺K⁺-ATP酶分解ATP生成ADP及無機磷，通過測定無機磷的量來確定ATP酶活性。

試劑的組成和配制：

試劑四：粉劑×3 支，-20℃保存。用時每支加1ml蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑七：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時加入25ml蒸餾水，溶解后4℃保存一周；

試劑八：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時加入25ml蒸餾水，溶解后4℃保存一周；

0.5μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將貯備液 20倍稀釋，即取 0.1ml試劑十加1.9ml蒸餾水充分混勻。

定磷劑的配制：按H₂O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 ml玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣品酶液的制備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

操作步驟:

1、分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至660nm，蒸餾水調(diào)零。

2、酶促反應(yīng)（在EP管中加入下列試劑）：

混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）準(zhǔn)確水浴10min;

混勻，8000g，25℃離心10min，取上清液;

3、定磷(在1.5mlEP管中依次加入下列試劑)

混勻，室溫放置30 min，在 660nm處比色。

注意:

1、由于每一個樣都必須做對照，本試劑盒50管保證測 24份Na⁺K⁺-ATP酶。

2、此法具有微量、靈敏、快速的特點。所以對測定所用試管要求嚴(yán)格無磷。

3、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。

計算:

1、血清（漿）Na⁺K⁺-  ATPase活力的計算:

定義：每小時每毫升血清（漿）中Na⁺K⁺- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Na⁺K⁺-ATP酶活力（μmol/h/ml）=[C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷V樣÷T=7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中Na⁺K⁺- ATPase活力的計算：

（1）按蛋白濃度計算：

定義：每小時每毫克組織蛋白中Na⁺K⁺- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Na⁺K⁺-ATP酶活力(μmol/h /mg)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷（Cpr×V樣）÷T =7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

定義：每小時每克組織中Na⁺K⁺-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Na⁺K⁺-ATP酶活力(μmol/h/g)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷(W× V樣÷V樣總)÷T=7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

定義：每小時每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞中Na⁺K⁺-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Na⁺K⁺-ATP酶活力(μmol/h /10⁴)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.015×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）

C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/ml；V總：酶促反應(yīng)總體積，0.5ml；V樣：加入樣本體積，0.2ml ；V樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時間，1/6小時；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。