測(cè)定意義V

淀粉酶負(fù)責(zé)水解淀粉，包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)可隨機(jī)地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時(shí)使淀粉的粘度降低，因此又稱為液化酶。

測(cè)定原理：

還原糖還原3,5-二硝基水楊酸生成棕紅色物質(zhì)。β-淀粉酶不耐熱，在70℃鈍化15min，從而測(cè)定α-淀粉酶活性。

組成：

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、玻璃比色皿、研缽和蒸餾水。

粗酶液制備：

組織：稱取0.1~0.2g樣本（建議稱取約0.1g樣本），加1 ml蒸餾水勻漿；將勻漿倒入離心管中，在室溫下放置提取15min，每隔5min振蕩1次，使其充分提??；3000g，25℃離心10min，吸取上清液并且加蒸餾水定容至10 ml，搖勻，即為淀粉酶原液。

血清（漿）：直接檢測(cè)。

操作步驟和加樣表（在1.5mlEP管中依次加入下列試劑）：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到540 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一或試劑二40℃預(yù)熱10min

3、測(cè)定步驟

70℃水浴15min左右，冷卻

在40℃恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫5min

混勻，95℃水浴5min，冷卻， 540nm處讀取對(duì)照管和測(cè)定管吸光度，計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。

α-淀粉酶活性計(jì)算：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸曲線為y=3.7215x -0.1778； x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/ml），y為吸光值。

2、α淀粉酶活性

（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。

α淀粉酶活性(mg/min/g鮮重)=[(ΔA＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=1.075×(ΔA＋0.1778)÷W

（2）按照蛋白質(zhì)含量計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活性單位。

α淀粉酶活性(mg/min/mg prot)= [(ΔA＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷（V樣×Cpr）÷T=0.1075×(ΔA＋0.1778) ÷Cpr

（3）血清（漿）樣本中α淀粉酶活性計(jì)算

單位定義：每ml血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活性單位。

α淀粉酶活性(mg/min/ml)= [(ΔA＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷V樣÷T=0.1075×(ΔA＋0.1778)

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.5ml；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.25 ml；V樣總：提取液總體積，10 ml； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，5min。