測(cè)定意義：

ICL（EC4.1.3.1）主要存在于植物和微生物中，油料作物種子在萌發(fā)過程中，通過乙醛酸循環(huán)及其他過程將脂肪轉(zhuǎn)變成碳水化合物。ICL是乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一。

測(cè)定原理：

ICL催化異檸檬酸降解為乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在340nm下有特征吸收峰，監(jiān)測(cè)340nm吸光度的減小速率可間接反應(yīng)ICL活性。

試劑組成和配制：

試劑三：粉劑×3瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入5ml蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑仍-20℃保存；

試劑四：粉劑×3瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入5ml蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑五：液體800μl×2支，4℃保存；臨用前每支加入560μl蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑仍4℃保存；

試劑六：粉劑×3瓶，4℃保存；臨用前每瓶加入5ml蒸餾水，充分混勻待用。用不完的試劑-20℃保存。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、移液器、1ml石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：

先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至570nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表(在1.5ml棕色EP管中按下表依次加樣）：

混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴5min

將上述試劑按順序加入1 ml玻璃比色皿中，加試劑六的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，在340nm波長下記錄20秒時(shí)的初始吸光度A1和2分20秒時(shí)的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

注意：

若一次性測(cè)定樣本較多，可將試劑一、二、三、四、五和樣本按比例配成混合液，在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴5min以上，測(cè)定時(shí)加入1220μl混合液和300μl試劑六測(cè)定。

ICL活性計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白中每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

ICL（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=2443×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

ICL（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=2443×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

ICL（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=4.886×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1.52×10-3 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。