測(cè)定意義：

MAO(EC1.4.3.4) 主要存在于脊椎動(dòng)物的各種器官，特別是分泌腺、腦、肝臟，在無(wú)脊椎動(dòng)物、豆類的芽等植物中也存在催化單胺類物質(zhì)代謝，含量較低，具有重要的生理功能，其活性能反映肝纖維化的程度。此外，MAO活性異常導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)出現(xiàn)紊亂，從而引發(fā)多種病癥。

測(cè)定原理：

MAO催化單胺類底物脫氨生成相應(yīng)的醛，進(jìn)一步氧化成酸；底物在360nm處有特征吸收峰，測(cè)定360nm光吸收下降的速率，計(jì)算MAO活性。

試劑組成和配制：

需自備儀器和用品：

天平、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水。

粗酶液提取：

1、稱取約0.1g樣品，加1 ml預(yù)冷的提取液一充分冰浴勻漿，1000g，4℃，離心10min，棄沉淀；把上清轉(zhuǎn)移到另一預(yù)冷的離心管，10000g，4℃，離心30min，棄上清；加入1ml預(yù)冷的提取液二，震蕩混勻，16000g，4℃，離心40min，棄上清；沉淀加入預(yù)冷的1ml 試劑一，震蕩混勻，即粗酶液（可用于可溶性蛋白濃度測(cè)定）。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1ml提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，棄沉淀；把上清轉(zhuǎn)移到另一預(yù)冷的離心管，10000g，4℃，離心30min，棄上清；加入1.0 ml預(yù)冷的提取液二，震蕩混勻，16000g，4℃，離心40min，棄上清；沉淀加入預(yù)冷的1.0 ml 試劑一，震蕩混勻，即粗酶液（可用于可溶性蛋白濃度測(cè)定），取上清置于冰上待測(cè)。

3、血清：直接測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至360nm，蒸餾水調(diào)零。

2、操作表：

混勻，于微量石英比色皿/96孔板，對(duì)照管調(diào)零，測(cè)定360nm處吸光值A1，然后37℃水浴60min，對(duì)照管調(diào)零，測(cè)定360nm處吸光值A2。ΔA=A1-A2 注意：空白管只需測(cè)定一次。

MAO活性計(jì)算公式：

a．用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、按蛋白含量計(jì)算

酶活定義：37℃，pH7.6時(shí)，每毫克蛋白質(zhì)1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性（nmol/min / mg prot）= ×V反總÷（V樣× Cpr）÷T= 114×ΔA÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活定義：37℃，pH7.6時(shí)，每克樣品1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性（nmol/min / g 鮮重）=×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T = 114×ΔA÷ W

3、按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：37℃，pH7.6時(shí)，每104個(gè)細(xì)胞1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性（nmol/min / 104 cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量）÷T

= 114×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

4、按照液體體積計(jì)算

酶活定義：37℃，pH7.6時(shí)，每升血清1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性（nmol/min /L）=×V反總÷V樣=114×ΔA

ε：底物摩爾消光系數(shù)，1460L /mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.2ml；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.02ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；T：反應(yīng)時(shí)間，60min，W：樣本質(zhì)量，g

a．用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、按蛋白含量計(jì)算

酶活定義：37℃，pH7.6時(shí)，每毫克蛋白質(zhì)1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性（nmol/min / mg prot）= ×V反總÷（V樣× Cpr）÷T= 228×ΔA÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活定義：37℃，pH7.6時(shí)，每克樣品1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性（nmol/min / g 鮮重）=×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T = 228×ΔA÷ W

3、按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：37℃，pH7.6時(shí)，每104個(gè)細(xì)胞1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性（nmol/min / 104 cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量）÷T

= 228×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

4、 按照液體體積計(jì)算

酶活定義：37℃，pH7.6時(shí)，每升血清1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1nmol底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

DAO活性（nmol/min /L）=×V反總÷V樣=228000×ΔA

ε：底物摩爾消光系數(shù)，1460L /mol /cm； d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.2ml；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.02ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；T：反應(yīng)時(shí)間，60min，W：樣本質(zhì)量，g

注意事項(xiàng)：

吸光度變化應(yīng)該控制在0.01～0.8之間。否則加大樣品量或稀釋樣品，注意計(jì)算公式中參與計(jì)算的稀釋倍數(shù)要相應(yīng)改變。