測(cè)定意義：

焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶（PFP，EC2.7.1.90）是一種胞質(zhì)酶，廣泛存在于植物組織中，催化果糖-6-磷酸與果糖-1,6-二磷酸之間的可逆轉(zhuǎn)化，在光合作用碳代謝中起重要作用。

測(cè)定原理：

PFP催化6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為1,6-二磷酸果糖，它在醛縮酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>3-磷酸甘油醛，再由3-磷酸甘油醛脫氫酶和NADH催化生成3-磷酸甘油酸、NAD和磷酸，340nm處的吸光度變化反映了PFP的活性的高低。

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加5ml蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加5 ml蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：液體0.5ml×1瓶，4℃避光保存。

試劑五：液體0.5ml×1瓶，4℃避光保存。

試劑六：液體5ml×1瓶，4℃避光保存。

自備儀器和用品：

天平、低溫離心機(jī)、研缽、紫外分光光度計(jì)、1 ml石英比色皿。

酶液提?。?/span>

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1ml提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1ml提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

3. 液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 取1ml石英比色皿，依次加入580μl試劑一，100μl試劑二，100μl試劑三，10μl試劑四，10μl試劑五，100μl試劑六，100μl粗酶液，充分混勻，記錄340nm處10s的吸光值A1和310s的吸光值A2，△A=A1-A2

計(jì)算公式：

（1）按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PFP（nmol/min/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PFP（nmol/min /g 鮮重）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

（3）按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PFP（nmol/min /10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按照液體體積計(jì)算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PFP（nmol/min /ml）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T=321.54×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1ml；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g