測定意義：

丙酮酸磷酸雙激酶（pyruvate phosphate dikinase, PPDK, EC 2.7.9.1）是C4途徑和景天科酸代謝途徑的限速酶，催化ATP、丙酮酸和Pi經(jīng)三步反應(yīng)生成磷酸烯醇式丙酮酸。該酶主要存在于C4植物的葉綠體基質(zhì)中，對光合功能具有重要調(diào)節(jié)作用。

測定原理：

PPDK的逆向反應(yīng)催化磷酸烯醇式丙酮酸、AMP和PPi生成丙酮酸、ATP和Pi，乳酸脫氫酶進(jìn)一步催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD⁺，在340nm測定NADH減少速率，計(jì)算PPDK活性。

組成：

試劑三 ：液體60μl×1支，4℃保存；體積較少，若沾在管壁上，臨用前可低速離心后使用。

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1ml石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟和加樣表：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

（1）工作液的配制：臨用前取試劑二一瓶加入25ml試劑一和12.5μl試劑三，充分混勻，置于37℃水浴5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

（2）在1ml石英比色皿中加入50μl樣本和950μl工作液，混勻，立即記錄340nm處初始吸光值A1和37℃反應(yīng)5min后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

PPDK活性計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PPDK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PPDK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=643×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。