測定意義：

GSH/GSSG是細胞內(nèi)最重要的氧化還原對之一。因此，測定細胞內(nèi)GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能夠很好地反映細胞所處的氧化還原狀態(tài)，也是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的主要指標之一。

測定原理：

利用2-VP法測GSSG含量。

組成：

試劑五： 液體30μl×1瓶，-20℃保存。臨用前加入0.6 ml試劑三稀釋，4℃保存。

試劑六：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入40 ml試劑三溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。

自備儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、1ml玻璃比色皿和蒸餾水。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml試劑一）進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清液（如上清不清澈，再離心3min）待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1ml試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；8000g 4℃離心10min，取上清液（如上清不清澈，再離心3min）的蒸餾水混勻待測。

3. 血清等液體：直接測定。

測定操作:

1. 分光光度計預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到412 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）水浴中保溫30min。

3. 測定管：取1 ml EP管，加入100 μ L上清液，5μ L試劑二，蓋緊后混勻，置于37℃水浴30min；依次加入100 μ L試劑四，10 μ L試劑五，700 μ L試劑六，迅速混勻后，立即測定30 s和150 s光吸收A1和A2，計算ΔA=A2-A1。

GSSG含量計算公式:

1、標準條件下測定的回歸方程為y=0.0276x-0.0011；x為標準品濃度（nmol/ml），y為吸光值(ΔA)。

2、 按蛋白濃度計算

GSSG（nmol/mg prot）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷(V樣×Cpr)

=36.23×(ΔA+0.0011)÷Cpr

3、按樣本鮮重計算

GSSG（nmol /g 鮮重）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷(V樣÷V樣總×W)

=36.23×(ΔA+0.0011)÷W

4、按細胞數(shù)量計算

GSSG（nmol/10⁴ cell）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷(V樣÷V樣總×細胞數(shù)量)

=36.23×(ΔA+0.0011)÷細胞數(shù)量

5、按照液體體積計算

GSSG（nmol/ml）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷V樣

=36.23×(ΔA+0.0011)

V樣：反應(yīng)中加入樣本體積，0.1ml；V樣總：加入提取液體積， 1ml；W：樣品質(zhì)量，g，Cpr：樣本蛋白濃度（mg/ml）

注意事項：

1. 提取過程中去掉蛋白質(zhì)，所以提取液不能用于測定蛋白含量。

2. 臨用前配制的試劑配好后4℃保存，2天內(nèi)使用完畢。

3. 最低檢出限為0.1μmol/L。

4. 反應(yīng)溫度.嚴格來說，為保證重復(fù)性，應(yīng)在25℃下進行反應(yīng)。

5. 反應(yīng)時間需精確控制，否則會影響反應(yīng)速率計算，產(chǎn)生較大誤差。

6. 樣品中的GSSG濃度盡可能低一些，否則反應(yīng)速率太大，沒法控制，所以稀釋倍數(shù)要盡量大些。