測(cè)定意義：

GR是廣泛存在于真核和原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶，是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的關(guān)鍵酶之一（通常昆蟲中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH還原GSSG生成GSH，有助于維持體內(nèi)GSH/GSSG比值。GR在氧化脅迫反應(yīng)中對(duì)活性氧清除起關(guān)鍵作用，此外GR還參與抗壞血酸－谷胱甘肽循環(huán)途徑。

測(cè)定原理：

GR能催化NADPH還原GSSG再生GSH，同時(shí)NADPH脫氫生成NADP⁺；NADPH在340 nm有特征吸收峰，相反NADP⁺在該波長(zhǎng)無(wú)吸收峰；通過(guò)測(cè)定340 nm吸光度下降速率來(lái)測(cè)定NADPH脫氫速率，從而計(jì)算GR活性。

組成：

試劑二：粉劑×2瓶，-20℃保存。臨用前加入3 ml蒸餾水，混勻。

試劑三：粉劑×2支，-20℃保存。臨用前加入1.5 ml蒸餾水，混勻。

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、移液器、1ml石英比色皿和蒸餾水

粗酶液提?。?/span>

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1ml試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心15min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 血清等液體：直接測(cè)定。

操作步驟：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一置于25℃（普通物質(zhì)）或者37℃（哺乳動(dòng)物）中預(yù)熱30min。

3. 測(cè)定管：取1ml石英比色皿，依次加入50μl試劑三，100μl試劑二， 750μl試劑一，100μl上清液，混勻，于340nm迅速測(cè)定初始吸光度和180 s吸光度，記為A測(cè)1和A測(cè)2，△A測(cè)定管= A測(cè)1﹣A測(cè)2。(注意加完上清液后迅速混勻測(cè)定)

計(jì)算公式：

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。

GR酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A測(cè)定管÷ε÷d×V反總×10⁹]÷[Cpr×V樣]÷T

= 536×△A測(cè)定管÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每克樣本每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。

GR酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ △A測(cè)定管÷ε÷d×V反總×10⁹] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 536×△A測(cè)定管÷W

(3) 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。

GR酶活(nmol/min/10⁴ cell)= [ △A測(cè)定管÷ε÷d×V反總×10⁹] ÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T            

= 536×△A測(cè)定管÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。

GR酶活(nmol/min/ml)= [ △A測(cè)定管÷ε÷d×V反總×10⁹]÷×V樣÷T

= 536×△A測(cè)定管

ε：NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×10³L/mol/cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，1000μl=0.001 L；10⁶：1 mol=1×10⁶μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/ml）；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100μl =0.1 ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，3 min。

注意事項(xiàng)：

（1）樣品處理等過(guò)程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力，勻漿液避免反復(fù)凍融；

（2）試劑二和試劑三須現(xiàn)配現(xiàn)用，配制完后，置于冰上，未使用完的4℃保存，三天內(nèi)使用完。

（3）測(cè)定前須先用1～2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，哺乳動(dòng)物組織一般須用試劑一稀釋2～5倍。

（4）細(xì)胞中GR活性測(cè)定時(shí)，細(xì)胞數(shù)目須在300萬(wàn)-500萬(wàn)之間，細(xì)胞中GR的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞。