測定意義：

GCL 是 GSH 合成的限速酶，GSH 對 GCL 有反饋抑制作用。GCL基因表達受多種因素調(diào)節(jié)，如氧化劑、抗氧化劑、生長因子和炎癥因子等。GCL活性高低對GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影響。

測定原理：

在ATP和Mg²⁺存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同時ATP去磷酸化產(chǎn)生無機磷分子，通過測定無機磷增加速率，即可計算出GCL活性。

組成：

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加14ml蒸餾水充分震蕩溶解。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入蒸餾水3.5 ml充分震蕩溶解。

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入30ml蒸餾水，充分震蕩溶解后，緩緩加入1.0 ml濃硫酸（自備），邊加邊攪拌。

自備儀器和用品：

可見分光光度計、冷凍離心機、水浴鍋、移液器、1ml玻璃比色皿、濃硫酸和蒸餾水。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1ml試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3. 血清等液體：直接測定。

GCL測定操作

1. 分光光度計預熱30min，調(diào)節(jié)波長到660 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管：取1.5mlEp管，依次加入試劑一240 μl、試劑二260μl、試劑三60μl和蒸餾水120μl，混勻后蓋緊，37℃水浴準確反應15 min； 再加入試劑四300μl，混勻后，25℃、8000g，離心10 min，取上清500μl，加入試劑五500μl，混勻后蓋緊，45℃水浴10min，冷卻后測定660 nm處吸光值，記為A空白管。

3. 測定管：取1.5mlEp管，依次加入試劑一240 μl、試劑二260μl、試劑三60μl和上清液120μl，混勻后蓋緊，37℃水浴準確反應15 min； 再加入試劑四300μl，混勻后，25℃、8000g，離心10 min，取上清500μl，加入試劑五500μl，混勻后蓋緊，45℃水浴10min，冷卻后測定660 nm處吸光值，記為A測定管。

注意：空白管只需要測定一次。

GCL活性計算公式：

標準曲線：y=0.1427x，R²=0.9987

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃下，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。

GCL（μg/min /mg prot）=[（A測定管-A空白管）÷0.1427×V反總]÷(Cpr×V樣)÷T

=3.815×（A測定管-A空白管）÷Cpr

（2）按樣本質量計算

活性單位定義：37℃下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機磷的GCL酶活量為為1個酶活單位。

GCL（μg/min /g鮮重）= [（A測定管-A空白管）÷0.1427×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 3.815×（A測定管-A空白管）÷W

（3）按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：37℃下，每10⁴個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。

GCL（μg/min /10⁴ cell）=[（A測定管-A空白管）÷ 0.1427×V反總]÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

= 3.815×（A測定管-A空白管）÷細胞數(shù)量

（4）按照液體體積計算

活性單位定義：37℃下，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。

GCL（μg/min /ml）= [（A測定管-A空白管）÷ 0.1427×V反總]÷V樣÷T

=  3.815×（A測定管-A空白管）

0.1427：回歸方程系數(shù)；V反總：反應總體積（ml）980μl=0.980ml；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/ml；V樣：加入反應體系中上清液體積，120μl =0.12 ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；W：樣本質量，g；T：反應時間：15min。

注意事項：

（1）樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力，以免影響其活力。如果是勻漿液，避免反復凍融。

（2）所有試劑配制完后，除表明4℃保存外，請于1天內(nèi)用完。

（3）實驗過程請帶手套，試劑三中有強腐蝕性物質，注意不要濺到皮膚上或眼睛內(nèi)。

（4）測定吸光值時請于水浴后10～40分鐘內(nèi)測完。

（5）樣本測定前先取1-2個樣做預實驗，如吸光值太高，應先用試劑一(或者生理鹽水)稀釋到適當倍數(shù)，使得吸光值在標準曲線范圍內(nèi)，哺乳動物組織和血液一般稀釋3～5倍。

（6）試劑三配制過程中，可能會產(chǎn)生黑色固體，其不影響結果，注意吸取時不要將黑色固體吸入。

（7）細胞中GCL活性測定時，細胞數(shù)目須在300萬-500萬之間，細胞中GCL的提取時可加試劑一（或生理鹽水）后研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞；