測(cè)定意義：

γ-GT是γ-谷氨酰循環(huán)中的關(guān)鍵酶，催化GSH降解。γ-GT催化GSH或者其他γ-谷氨?；衔锷系?/span>γ-谷氨?；D(zhuǎn)移到受體。也可以催化GSH和其他γ-谷氨酰基化合物的水解，產(chǎn)生谷氨酸鹽，在細(xì)胞外谷胱甘肽新陳代謝中起了重要的作用。

測(cè)定原理：

γ-GT催化谷氨酰對(duì)硝基苯胺中γ-谷氨?；D(zhuǎn)移給N-甘氨酰甘氨酸，生成對(duì)硝基苯胺，在405nm有特征光吸收；通過測(cè)定405nm光吸收增加速率，來計(jì)算γ-GT酶活性。

組成：

工作液（在試劑二瓶中配制）：臨用前配制，把試劑三倒入試劑二瓶中，充分溶解（室溫過低時(shí)可以40℃水浴促進(jìn)溶解）；然后把試劑四倒入試劑二瓶中，混勻后室溫保存。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、1ml玻璃比色皿和蒸餾水

粗酶液提?。?/span>

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1ml試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心15min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 血清等液體：直接測(cè)定。

γ-GT測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到405 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）水浴中預(yù)熱30min（保證無(wú)沉淀）。

3. 測(cè)定管：取1ml玻璃比色皿，依次加入100μl上清液，900μl工作液，混勻后于405nm測(cè)定10 s和70 s時(shí)吸光度，記為A1和A2。

γ-GT活性計(jì)算公式：

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.006x+0.0016，x為對(duì)硝基苯胺濃度，y為吸光值，R²=0.999。

 (1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。

γ-GT（μmol/min/mg prot）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V反總÷（Cpr×V樣）÷T

=1.67 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷ Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。

γ-GT（μmol/min/g 鮮重）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1.67 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。

γ-GT（μmol/min/10⁴ cell）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=1.67 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。

γ-GT（μmol/min/ml）= [ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V反總÷V樣÷T

= 1.67 × [ (A2－A1)－0.0016]

V反總：反應(yīng)體系總體積（L），1000μl=0.001 L；Cpr：蛋白濃度（mg/ml）；V樣：反應(yīng)體系中加入上清液體積（ml），100μl=0.1 ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間（min），1min。

注意事項(xiàng)：

1. 培養(yǎng)細(xì)胞中γ-GT活性測(cè)定時(shí)，細(xì)胞數(shù)目須在300萬(wàn)-500萬(wàn)之間，細(xì)胞中γ-GT的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞（防止因?yàn)榈鞍踪|(zhì)變性導(dǎo)致酶失活）。

2. 配置好的工作液2周內(nèi)使用完畢。