正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義：

維生素B6（Vitamin B6）又稱吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在體內以磷酸酯的形式存在，是一種水溶性維生素，在細胞中參與多種蛋白質和氨基酸的代謝，對生物體具有極其重要的作用。

測定原理：

VB6與4-氨基安替比林在強氧化劑作用下生成穩(wěn)定的黃色化合物，在390nm有特征吸收峰。

組成：

自備儀器和用品：

天平、研缽、離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、蒸餾水。

樣本處理：

1. 組織：將樣品磨碎，按照質量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入0.6ml提取液）加入提取液，60℃浸提30min，加蒸餾水0.4ml，混勻后于25℃，16000rpm離心10min，取上清測定（動物組織等蛋白含量較高的樣本建議離心20-30分鐘）。

2. 細胞：按照細胞數量（10⁴個）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入0.6ml提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；加蒸餾水0.4ml，混勻后于25℃，16000rpm離心10min，取上清測定。

3. 血清：直接測定。                

測定操作：

計算公式：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線：y = 0.3635x+0.0205，R² = 0.9986

1. 按照蛋白含量計算

VB6含量（μg/mg prot）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反總÷（V樣×Cpr）

                    = 13.76×（△A - 0.0205）÷ Cpr

2. 按照樣本質量計算

VB6含量（μg/g）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反總÷（V樣×W÷V樣總）

                = 13.76×（△A - 0.0205）÷ W

3. 按照細胞數量計算

VB6含量（μg/10⁴ cell）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反總÷（V樣×細胞數量÷V樣總）

                     = 13.76×（△A - 0.0205）÷ 細胞數量

4. 按照液體體積計算

VB6含量（μg/ml）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反總÷V樣

                  = 13.76×（△A - 0.0205）

V反總：反應總體積，0.2ml；：V樣：加入樣本體積，0.04ml；V樣總：加入提取液體積，1ml； Cpr：蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質量，g

b．用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y = 0.1818x+0.0205，R² = 0.9986

1. 按照蛋白含量計算

VB6含量（μg/mg prot）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V反總÷（V樣×Cpr）

                    = 27.52×（△A - 0.0205）÷ Cpr

2. 按照樣本質量計算

VB6含量（μg/g）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818 ×V反總÷（V樣×W÷V樣總）

                = 27.52×（△A - 0.0205）÷ W

3. 按照細胞數量計算

VB6含量（μg/10⁴ cell）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V反總÷（V樣×細胞數量÷V樣總）

                     = 27.52×（△A - 0.0205）÷ 細胞數量

4. 按照液體體積計算

VB6含量（μg/ml）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V反總÷V樣

                  =27.52×（△A - 0.0205）

V反總：反應總體積，0.2ml；：V樣：加入樣本體積，0.04ml；V樣總：加入提取液體積，1ml； Cpr：蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質量，g

注意事項：

1. 若測定結果中吸光值超過1，請將樣本稀釋后進行測定，并在計算公式中乘以稀釋倍數。

2. 蛋白濃度較高的樣品，比如動物組織，若顯色完成后有沉淀產生，將樣本稀釋后再測定，在計算公式中乘以稀釋倍數。

3. 顯色完成后立即進行測定。