溶液/懸浮液的制備

   使用瓶子1中提供的的產(chǎn)品（試劑一），這個(gè)溶液是有粘性的，因此應(yīng)使用移液器移取分裝。（4℃下穩(wěn)定性> 3年）稀釋后試劑一：取2 ml瓶子1中溶液用100mM  pH6.0順丁烯二酸鈉緩沖液稀釋至22ml。（注：以5 ml為單位分裝后用聚乙烯管冷凍保存，反復(fù)凍融不會(huì)影響穩(wěn)定性，穩(wěn)定性-20℃ >5年）

沒有提供的試劑（應(yīng)購買分析純級(jí)）

1.順丁烯二酸鈉（馬來酸鈉）緩沖液(100mM，pH6.0)加上2mM二水氯化鈣和疊氮化鈉（0.02%w/v）：用1600ml蒸餾水溶解23.2g順丁烯二酸，用4M（160g/L）氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.0，加入0.6g二水氯化鈣和0.4g疊氮化鈉，混合并溶解，定容至2L。（4℃下可保存一年）

2.醋酸鈉緩沖液（1.2M，PH3.8）：將69.6ml的冰醋酸（1.05g/ml）加至800 ml的蒸餾水中，用4M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至pH3.8，用蒸餾水定容至1L。（室溫下可保存一年）

3.醋酸鈉緩沖液（100mM，PH4.5）：將5.8ml的冰醋酸加至900 ml的蒸餾水中，用4M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至4.5，用蒸餾水定容至1L。（4℃保存2個(gè)月）

4.氫氧化鉀溶液（2M）：將112.2gKOH加至900 ml的去離子水中，攪拌溶解。定容至1L，密封保存。（室溫下可保存2年）

5.含水乙醇（或者IMS）（大約50%v/v）：將500ml乙醇（95%v/v或者99%v/v）或者工業(yè)甲基化酒精（IMS；變性乙醇；95% v/v 乙醇加上5%甲醇）至500ml的水中，密封保存。（室溫下穩(wěn)定保存>2年）

設(shè)備（推薦）

1. 離心式粉碎機(jī)，帶有齒輪轉(zhuǎn)子和1.0mm篩子，或類似的裝置。小型樣品可選擇旋風(fēng)磨碎機(jī)替代

2.絞肉機(jī)-手動(dòng)或電動(dòng)的，裝有4.5mm篩

3.臺(tái)式離心機(jī)-能夠放入16×120mm玻璃試管，速度大約1500g(3000rpm)

4.振蕩水浴器，可設(shè)定為每分鐘100次直線運(yùn)動(dòng)（振蕩速度為每分鐘200里程），振蕩距離35mm,37℃

5.水浴鍋-能夠保持在50+0.1℃

6.渦旋混勻器

7.磁力攪拌器

8.磁力攪拌棒-5×15mm

9.pH計(jì)

10.計(jì)時(shí)器

11.分析天平（精確到0.1毫克）

12.分光光度計(jì)-能夠設(shè)定510nm（10mm路徑長度）

13.100μL移液器及一次性槍頭

14.連續(xù)分配器配有50ml管嘴，能夠移取2.0ml，3.0ml和4.0ml

15.培養(yǎng)管-螺旋帽，16×125mm

16.玻璃試管-16×100mm，14ml容量

17.塑料盒，可放置試管架，也可作為冰盒使用

18.溫度計(jì)-能夠讀取37+0.1℃和50+0.1℃

19.容量瓶-100ml，200ml，500ml，1L，2L

樣品制備

用磨碎機(jī)研磨大約50g谷物樣品或凍干植物或食品，使樣品粉末可過1.0mm篩，轉(zhuǎn)移所有的材料至廣口瓶，顛倒振蕩混勻。工業(yè)淀粉一般不用研磨，用絞肉機(jī)粉碎鮮樣（如罐裝的豆子，香蕉，土豆），過4.5mm篩，測(cè)定干樣中的含水量，根據(jù)AOAC法925.10，凍干后烘爐干燥測(cè)定鮮樣中的含水量。

分析方法

（a）水解和溶液化非抗性淀粉

1.準(zhǔn)確稱取100mg（±5 mg）樣品后直接倒入有螺旋帽的試管里，輕柔的拍打試管以保證樣品集中在底部。

注意：對(duì)于濕樣，樣品大概為0.5g（準(zhǔn)確稱重），這些材料的含水量通常為60-80%。

2.每個(gè)試管中加入4.0 ml試劑二。

3.蓋緊試管蓋子，用渦旋振蕩器混勻，臥式放入振蕩水浴器，與運(yùn)動(dòng)方向平行。

如下圖所示：

5.把試管從水浴鍋中拿出，用紙巾擦掉多余的水，拿開蓋子，加入4.0ml乙醇（99% v/v）或者IMS（99% v/v），用渦旋器渦旋。

6.1500g離心，10分鐘（不加蓋）。

7.小心倒出上清，加入2ml 50%乙醇或50% IMS重懸浮，用渦旋器渦旋，再加入6ml 50%IMS，混合，1500g離心，10分鐘。

8.小心倒出上清，重復(fù)上述重懸浮和離心步驟。

9.小心倒出上清，翻轉(zhuǎn)試管，用紙巾吸除多余的液體。

（b）測(cè)定抗性淀粉含量

1.將試管冰浴，再向每個(gè)試管中加入磁力攪拌棒和2 ml 2M的KOH，用磁力攪拌機(jī)在冰浴/水浴狀態(tài)下攪拌20min，以重懸浮絮狀物和溶解RS。

如下圖所示：

備注：

（1）不要使用渦旋器混勻，那將會(huì)導(dǎo)致淀粉乳化。

（2）確保邊加入KOH溶液邊劇烈攪拌試管里的樣品，這將會(huì)避免形成難溶的淀粉塊。

2.向每個(gè)試管中加入8 ml （1.2M  pH3.8）醋酸鈉緩沖液，并用磁力攪拌機(jī)攪拌，立即加入0.1ml試劑一,混勻，并放入50℃水浴。

3.孵育30min,期間用渦旋器間歇混勻。

4.對(duì)于RS含量>10%的樣品，用水洗瓶定量轉(zhuǎn)移試管里的樣品至100ml容量瓶，當(dāng)用洗瓶洗滌試管中的溶液時(shí)用外磁鐵保持試管中的磁力棒，用蒸餾水定容至100ml，并混勻，以單位體積離心溶液，1500g，10min。

5.對(duì)于RS含量<10%的樣品，直接離心1500g,10min（非稀釋），對(duì)于這些的樣品，試管里的最終體積大約為10.3ml。（體積可能會(huì)變化，如果分析的是濕樣，在計(jì)算數(shù)值時(shí)應(yīng)注意折扣）

6.將稀釋的（4）或非稀釋的（5）上清液以0.05ml為單位轉(zhuǎn)移至玻璃試管（16×100mm），一式兩份，加入1.5mlGOPOD試劑，50℃孵育20分鐘。

7.孵育完成后各取出200ul溶液，分別測(cè)量每一個(gè)溶液的在510nm下相對(duì)于空白試劑的吸光度值。（備注：反應(yīng)結(jié)束后，放冷5min內(nèi)測(cè)完結(jié)果）

制備空白試劑

準(zhǔn)備空白試劑：通過混勻0.05ml的100mM的醋酸鈉緩沖液（pH4.5）和1.5ml的GOPOD試劑，孵育完成后各取出200ul溶液進(jìn)行同上檢測(cè)。

制備D-葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)品（一式四份）通過混合0.05mlD-葡萄糖（1mg/ml）和1.5ml的GOPOD試劑，孵育完成后各取出200ul溶液進(jìn)行同上檢測(cè)。

（c）計(jì)算非抗性（可溶性的）淀粉

1.收集起始孵育[(a)7]過程中離心獲得上清液和兩次50%乙醇洗滌[(a)8和9]獲得的上清液至容量瓶中，用100mM的醋酸鈉緩沖液（pH4.5）定容至100ml，混勻。

2.以0.05 ml為單位孵育溶液（一式兩份）并加入5μL稀釋試劑一, 50℃孵育20分鐘,加入1.5 ml GOPOD試劑，50℃孵育20分鐘，孵育完成后各取出200ul溶液，分別測(cè)量每一個(gè)溶液的在510nm下相對(duì)于空白試劑的吸光度值。（備注：反應(yīng)結(jié)束后，放冷5min內(nèi)測(cè)完結(jié)果）

3.計(jì)算在510nm下相對(duì)于空白試劑的吸光度值。

4.計(jì)算非抗性淀粉的含量。

計(jì)算

計(jì)算樣品中抗性淀粉含量，非抗性淀粉含量和總淀粉含量（%，在干重的基礎(chǔ)上），計(jì)算模板如下：

抗性淀粉（g/100g樣品）（樣品包含>10%RS） = ΔE×F×100/0.1×1/1000×100/W×162/180

= ΔE×F/W×90

抗性淀粉（g/100g樣品）（樣品包含<10%RS）= ΔE×F×10.3/0.1×1/1000×100/W×162/180

= ΔE×F/W×9.27

非抗性淀粉含量（g/100g樣品）=ΔE×F×100/0.1×1/1000×100/W×162/180

=ΔE×F/W×90

總淀粉含量=抗性淀粉含量+非抗性淀粉含量

ΔE=相對(duì)于空白試劑的吸光度值；        

162/180=從測(cè)定獲得的游離D-葡萄糖轉(zhuǎn)換到淀粉中存在的脫水-D-葡萄糖的因子；

F=從吸光度值到微克的轉(zhuǎn)換（在GOPOD反應(yīng)中50μgD-葡萄糖的吸光度值是確定的，F=50（D-葡萄糖的μg數(shù)）除以這50μgD-葡萄糖的GOPOD吸光度值）；

100/0.1=體積校正（從100ml取0.1ml）；           1/1000=從ug到mg的轉(zhuǎn)換；

W=分析樣本的干重 =重量×（100-含水量）/100；    100/ W=RS在樣品重量中百分比因子；

10.3/0.1=體積校正（從10.3 ml取0.1ml），對(duì)于含有0-10%RS，當(dāng)孵育溶液時(shí)沒有被稀釋。