CRISPR/Cas系統(tǒng)在感染性疾病診斷中的應用
摘要
成簇規(guī)律間隔短回文重復序列（CRISPR）/CRISPR相關蛋白（Cas）系統(tǒng)，作為原核生物的適應性免疫防御系統(tǒng)，近年來已經(jīng)被開發(fā)成為一種高效的分子診斷工具，其特異、靈敏、快速、便捷等優(yōu)勢使得其在分子診斷領域，尤其是在感染性疾病的診斷上有著極佳的發(fā)展前景。本文旨在對CRISPR/Cas系統(tǒng)在感染性疾病診斷的應用現(xiàn)狀、優(yōu)勢和局限以及未來的研究方向做一介紹和探討。
感染性疾病因為其高發(fā)病率和高死亡率，嚴重威脅人類生命健康。尤其是傳染性強、突變率高的病原體易形成大流行，是對全球公共衛(wèi)生系統(tǒng)的巨大考驗。對感染性疾病進行早期快速準確的診斷是降低其病死率，改善預后，限制傳播的關鍵性舉措，也是檢驗醫(yī)學研究的重要內(nèi)容。核酸檢測是感染性疾病診斷的重點，與抗原、抗體檢測相比，具有更高的靈敏度和特異度，對于早期診斷最為準確可靠［1］。然而傳統(tǒng)的基于聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction， PCR）的核酸擴增鑒定方式對儀器、檢測環(huán)境、操作人員要求較高，因此被局限在醫(yī)學實驗室，而且檢測成本高，耗時長。這些缺點極大限制了其在感染性疾病診斷上，尤其是在醫(yī)療不發(fā)達地區(qū)暴發(fā)的新發(fā)傳染病的診斷上的應用。理想的病原體核酸檢測方式應該是準確、靈敏、快速、廉價、便攜，并且能在各種環(huán)境下對任何病原體進行檢測，目前還沒有這樣一種完全理想化的核酸檢測平臺。
近年來，基于成簇間隔的短回文重復序列及其關聯(lián)蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated proteins，CRISPR/Cas）的新型分子診斷工具，似乎具有成為這樣理想化核酸檢測平臺的潛力。其相較于傳統(tǒng)的基于PCR的核酸檢測方式，不僅表現(xiàn)出了同樣優(yōu)異的特異度和靈敏度，而且更加省時，對設備、操作人員及環(huán)境要求更低，還能開發(fā)為試紙用于即時檢驗，諸多優(yōu)勢更加貼合感染性疾病診斷的要求。這一技術方興未艾，有望成為下一代感染性疾病分子診斷的尖兵利器［2］。本文旨在對基于CRISPR/Cas的分子診斷平臺在感染性疾病診斷上的應用現(xiàn)狀、優(yōu)勢和局限以及未來研究方向做一述評，希望能為CRISPR技術在感染性疾病診斷上的發(fā)展提供一些有價值的梳理和總結。
一、CRISPR/Cas系統(tǒng)簡介
CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種原核生物用來抵抗外來遺傳物質(zhì)入侵的適應性免疫防御系統(tǒng)，在分子水平上，該系統(tǒng)通過適應、成熟和干擾3個階段發(fā)揮免疫功能。在第一步，當有噬菌體或病毒入侵時，細菌免疫防御機制激活，剪切入侵基因片段并將其整合到CRISPR序列中，以便下一次入侵時，細菌能再次識別。在表達階段，間隔序列翻譯成包含有入侵序列的 CRISPR核糖核酸（CRISPR RNA，crRNA）和反式激活RNA（trans-activating crRNA， tracrRNA），兩者通過堿基配對形成向?qū)NA（single-guide RNA，sgRNA），用于Cas蛋白的募集，最后一步，sgRNA和Cas蛋白結合形成復合物，sgRNA通過序列互補來捕捉靶標，Cas蛋白則發(fā)揮活性內(nèi)切酶活性進行切割，從而清除外來遺傳物質(zhì)，發(fā)揮免疫作用［3］。理論上，通過控制sgRNA的序列，CRISPR/Cas可以識別任何序列，這是其能在基因編輯、分子診斷領域得到廣泛應用的基礎。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了2類、6種亞型CRISPR-Cas系統(tǒng)。1類CRISPR/Cas系統(tǒng)利用crRNA和多效應復合物來識別和切割靶序列，而2類系統(tǒng)利用單個多結構域Cas蛋白和crRNA發(fā)揮作用。由于2類CRISPR/Cas系統(tǒng)簡單高效且易于控制，已廣泛應用于基因編輯和分子診斷，包括Ⅱ型（即cas9）、Ⅴ型（即Cas12a和Cas12b）和Ⅵ型（即Cas13a和Cas13b）［4］。CRISPR特異性識別切割靶序列的能力最開始被用于基因編輯領域，在這個過程中，有學者利用Cas9的特性，結合等溫擴增等技術將其用于病原體的檢測。但直到2016年Cas12和Cas13附屬切割活性的發(fā)現(xiàn)，才使得這一技術在分子診斷領域開始了飛速的發(fā)展。這種附屬切割活性是指，Cas蛋白一旦在sgRNA的指引下捕捉到了靶序列，其被激活切割靶序列的同時，還會以極高的效率切割周圍環(huán)境中的核酸片段，這樣的特點使得其自帶信號放大的功能，并且圍繞這一特性可以設計諸多新穎的信號讀出方式。另外值得注意的是，Cas9和Cas12識別切割靶序列均需要前間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif， PAM）的協(xié)助，例如SpCas9需要NGG序列，LbCas12需要TTTN序列，當靶序列附近沒有合適的PAM序列時，會限制其運用，尤其是在單核苷酸多態(tài)性的識別及其他短序列的檢測上。學者們在擴增靶標時，使用一個包含PAM序列的引物，人為在擴增產(chǎn)物上加上PAM序列，則解決了這一問題［5］。同樣Cas13對RNA的識別有側翼位點（protospacer flanking sequence， PFS）序列要求，即靶標前不能有G堿基，則可以通過轉換間隔序列解決［6］。這些策略進一步擴展了其在檢測上的應用范圍。
二、CRISPR/Cas系統(tǒng)在感染性疾病診斷中的應用研究現(xiàn)狀
CRISPR/Cas9、Cas12、Cas13已被開發(fā)成多種分子診斷策略用于各種病原體，包括細菌和病毒的核酸檢測，尤其是利用Cas12、Cas13的附屬切割活性開發(fā)出的SHERLOCK系列、HOLMES系列和DETECTR等檢測平臺，為感染性疾病的快速診斷提供了新的契機。
1.基于CRISPR/（d）Cas9 的感染性疾病核酸檢測平臺：CRISPR/Cas9由于具有精確的靶標序列識別和切割的能力，因此具有開發(fā)成分子診斷工具的潛力。Pardee等［7］在2016年結合Cas9和NASBA（核酸依賴性擴增檢測技術），借toehold生物傳感器開發(fā)出一種恒溫可視化的檢測平臺，用于肉眼檢測寨卡病毒，并利用其識別單核苷酸多態(tài)性的能力用于美洲寨卡和非洲寨卡的基因分型。Huang等［8］開發(fā)了一種CAS-EXPAR平臺，將Cas9切割后的產(chǎn)物作為引物，利用指數(shù)擴增反應（exponential amplification reaction， EXPAR）進行擴增，之后對產(chǎn)物進行熒光顯色（圖1A）。該平臺能夠在1 h內(nèi)檢測李斯特菌，并且具有阿摩爾級別（10-18/L）的靈敏度和單堿基分辨的特異度。
2.基于CRISPR/Cas13的感染性疾病核酸檢測平臺：Ⅵ型CRISPR系統(tǒng)包含一個名為Cas13a的“效應器”蛋白，其識別靶標類型是單鏈RNA而非DNA（圖1C）。張鋒團隊利用其附屬切割的特點建立起的第一個檢測平臺稱為SHERLOCK［6］。在這個平臺中，首先對靶標進行重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification， RPA）或逆轉錄重組酶聚合酶擴增（reverse transcription-recombinase polymerase amplification， RT-RPA），然后再進行T7轉錄，靶標被擴增的同時也使得檢測的靶標類型不局限于RNA。他們利用SHERLOCK成功對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、結核分枝桿菌、肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌進行了鑒定，并且區(qū)分出了肺炎克雷伯菌不同的耐藥基因。基于SHERLOCK的檢測方式檢測耗時在2 h內(nèi)，并且單次檢測的成本低廉，為核酸檢測開啟了新篇章。在此基礎上，張鋒課題組還開發(fā)出了SHERLOCKv2［11］，即SHERLOCK的二代版本，將Cas13a與Csm6（一種輔助的CRISPR Ⅲ型核酸酶）聯(lián)用，兩者協(xié)同作用使得信號得以增強，使檢測靈敏度較一代提高了3.5倍。通過用稀釋的等溫擴增引物進行非飽和反應，從一代的定性檢測變?yōu)橄鄬Χ繖z測。通過應用帶有抗FAM抗體和金納米粒子的紙基傳感器，開發(fā)出了便攜式試紙條。此外，通過將篩選出的在附屬切割上有序列偏好的3種Cas13蛋白和1種Cas12a蛋白在一個體系中應用，實現(xiàn)了一個體系同時檢測4種病原體。這4點性能的提升和突破使得SHERLOCK在感染性疾病檢測上變得更加靈敏、實用、便攜和高效，例如在醫(yī)療條件相對落后地區(qū)，不論是DNA、RNA還是細菌感染導致的肺炎都可以用這種方式進行檢測，還可以進行人類免疫缺陷病毒滴度監(jiān)測以指導抗病毒治療等。從這些優(yōu)勢中足以預見這種新型分子診斷平臺在感染性疾病診斷上有著極佳的前景。之后，張鋒團隊又將一種通過加熱和化學還原的方式裂解病毒顆粒和滅活核糖核酸酶的樣本預處理方法（HUDSON）添加到SHERLOCK樣本處理步驟中，使得SHERLOCK可以直接用于從臨床樣本中檢測病毒核酸，而省去提取和純化的樣本預處理步驟［12］。這進一步縮短了樣本周轉時間，簡化了步驟，這對于將CRISPR/Cas用于病原體的實時快速檢驗有非常重要的意義。
3.基于CRISPR/Cas12的感染性疾病核酸檢測平臺：Ⅱ類V-A型Cas12蛋白也被發(fā)現(xiàn)具有反式切割活性，但與Cas13不同，Cas12靶向DNA并附屬切割單鏈DNA（圖1D）。利用Cas12首先開發(fā)出的平臺包括HOLMES和DETECTR。Li等［5］用HOLMES檢測DNA/RNA病毒，可在1 h內(nèi)從細胞系或臨床樣本中檢測病毒基因型和人類單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP），并且靈敏度也可達到阿摩爾級。之后的HOLMESv2利用Cas12b具有很寬的反式切割活性溫度范圍特點，將其與環(huán)介導的等溫擴增方式相結合，實現(xiàn)了一個集靶標擴增和信號轉化的“一鍋式”核酸檢測系統(tǒng)，支持定量檢測靶DNA［13］。這是迄今為止用于RNA檢測的最簡單的CRISPR生物傳感平臺。Chen等［14］利用DETECTR快速準確地鑒定了各種亞型的HPV病毒。與SHERLOCK類似的是，HOLMES或是DETECTR都可以通過剪切熒光報告探針實現(xiàn)熒光信號檢測或結合紙基傳感策略實現(xiàn)肉眼可見的試紙條檢測（圖1E）。
2019年，James課題組提出了一種對傳統(tǒng)材料進行分子編程后用于生物傳感的策略。他們將Cas12a-gRNA復合物嵌入連有單鏈DNA的晶格結構中制成水凝膠［15］。當水凝膠系統(tǒng)暴露于靶標DNA存在的環(huán)境中時，Cas12a被激活，其對周圍單鏈DNA的反式切割使得水凝膠的骨架被剪切破壞，從而造成水凝膠的塌陷。在生物傳感方面，用此策略檢測了葡萄球菌的mecA基因片段，激活的Cas12剪切將淬滅熒光基團連接于凝膠骨架的單鏈DNA，導致熒光信號產(chǎn)生。他們還將水凝膠嵌入微流控紙質(zhì)設備中，開發(fā)了一種可以對埃博拉病毒進行實施快速檢測的試紙條，這種試紙條在實戰(zhàn)中表現(xiàn)出相當好的靈敏度和可重復性。新穎的組合方式使得老材料用了新用法，這種創(chuàng)新的思路可以催生更多新穎的生物傳感策略［16］。表1比較了上述具有代表性的基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的病原體檢測分子診斷平臺的性能。
三、從新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）診斷中看CRISPR/Cas核酸檢測平臺的優(yōu)勢
2019年底，COVID-19疫情開始在全球范圍內(nèi)的多個國家暴發(fā)，這場疫情也為開發(fā)出的基于CRISPR/Cas的分子診斷平臺提供了實戰(zhàn)檢驗的機會。傳統(tǒng)的基于RT-PCR的方法可在4～6 h內(nèi)檢測病毒，結果相對可靠，然而在面臨傳染性高、突變率高的感染性疾病時，局限性也更加凸顯，其準確性和效率取決于樣本采集部位是否有足夠數(shù)量的病毒基因片段，采集的方法不對或者錯過采集的窗口時間可能導致假陰性結果，這在大流行階段是非常可怕的［17］。因此為了提高準確度必須反復檢測，這會大大增加時間及其他附加成本?；贑RISPR/Cas的分子診斷平臺則在一定程度上彌補了這些缺陷。
Chiu課題組將DETECTR開發(fā)用于2019-nCoV檢測，將病毒編碼包膜蛋白和核衣殼的基因作為檢測的靶點。整個過程包括：在62 ℃下進行20～30 min的RT-LAMP和在37 ℃下進行10 min的Cas12檢測反應，總用時大約30～40 min，并且是在試紙條上讀取結果。包括RNA提取的整個過程大約45 min，檢測限低至10拷貝數(shù)/μl，其準確度則與RT-PCR方法不相上下。更重要的是從病原體發(fā)現(xiàn)到開發(fā)出這樣成熟的檢測平臺也只需要2周左右［18］。
而張鋒團隊則公布了使用SHERLOCK平臺檢測2019-nCoV的標準流程。他們選用S基因和Orf1ab基因兩種2019-nCoV特異性序列作為檢測靶點，整個檢測過程包括核酸抽提擴增、Cas13反應以及試紙條檢測，耗時在1 h以內(nèi)，檢測限同樣低至10拷貝數(shù)/μl。但考慮到上述方法均需要分兩步，核酸擴增到Cas反應需要轉移樣本，增加了污染概率，張鋒和其他團隊合作又開發(fā)出了另一種結合環(huán)介導等溫擴增技術和Cas12b的2019-nCoV檢測方式，命名為“STOP”（SHERLOCK testing in one pot）［19］。和HOLMESv2類似，該方法旨在實現(xiàn)等溫擴增步驟和檢測一步反應，減少前處理的步驟，簡化流程，并使得樣本轉移更少，降低污染概率，從而進一步提升檢測的準確度。
總之，上述3個檢測平臺在2019-nCoV的診斷中均表現(xiàn)出了良好的靈敏度和特異度，并且速度更快、操作更方便、適用范圍更廣、單次檢測成本低廉，再次證明CRISPR/Cas核酸檢測平臺在傳染病診斷中的優(yōu)勢和前景。
四、CRISPR/Cas系統(tǒng)應用于感染性疾病診斷的優(yōu)勢與局限及未來研究方向
CRISPR/Cas系統(tǒng)毫無疑問為感染性疾病的診斷提供了新的方法和契機，總結來說，它具有如下優(yōu)點：（1）相較于基于PCR的傳統(tǒng)方法，毫不遜色的靈敏度和特異度。（2）檢測所需時間短。（3）簡單便攜，不依賴昂貴的儀器和嚴苛的實驗環(huán)境。（4）試劑耐受冷凍干燥，便于儲存和攜帶。（5）標本前處理可以非常簡單。（6）結果讀取方便，能通過熒光或者肉眼讀取結果。這幾大優(yōu)點使得CRISPR檢測平臺可以對病原體核酸分子實現(xiàn)實時快速檢測。
但是，CRISPR技術也有一些局限。第一，由于樣本中靶標的低豐度，大多基于CRISPR的檢測方式都需要結合特定的核酸擴增策略，盡管大部分是等溫擴增，相對PCR更加簡單，但這仍然是其向更加便捷、省時方向發(fā)展的阻礙。第二，CRISPR技術需要在病原體的基因序列完全清楚的情況下，才能設計gRNA開發(fā)出特異的核酸檢測平臺，這一點使得其在不明病原體引起的疾病流行初期能發(fā)揮的作用可能很有限。第三，由于CRISPR系統(tǒng)附屬切割活性具有持續(xù)性和隨意性，使得此檢測平臺在完全定量檢測、細胞原位檢測的應用上還有待突破。第四，實現(xiàn)類似于SHERLOCKv2一樣更多種病原體的高通量檢測難度較大。第五，脫靶效應的存在可能導致假陰性結果的產(chǎn)生。
因此根據(jù)以上幾點也不難推測未來CRISPR技術的兩大研究方向，第一，是新的Cas蛋白的開發(fā)及突變體的篩選鑒定。例如后來發(fā)現(xiàn)的Cas14蛋白，不同于Cas12和Cas13，其擅長識別單鏈DNA，豐富了CRISPR工具箱［20］。而具有不同切割特性的Cas蛋白的篩選鑒定為提高檢測通量及降低“脫靶效應”提供了方法。第二是將CRISPR/Cas其和其他的技術平臺結合起來，開發(fā)新穎實用的生物傳感策略，比如將Cas9蛋白固定于石墨烯場效應晶體管［21］，以及將Cas系統(tǒng)的報告探針固定于電極上，從而實現(xiàn)不需要使用信號擴增的電化學生物傳感器的構建［22］。使用水凝膠作為其響應原件實現(xiàn)多樣化的信號輸出［15］。與微流體技術結合開發(fā)出的CARMAN技術，可以對數(shù)十個樣本，上百種病毒進行快速檢測，為解決通量低的問題提供了方法等［23］。不斷地將新興的材料與技術與CRISPR技術結合實現(xiàn)優(yōu)勢互補，開發(fā)出更實用新穎的生物傳感策略用于感染性疾病診斷將是未來一段時間內(nèi)的研究重點。
總之，CRISPR/Cas技術作為新興的分子診斷策略，盡管有其局限，但其準確、靈敏、快速、廉價、便攜的特點已經(jīng)為核酸檢測帶來革命性變化，尤其在感染性疾病的檢驗診斷上有著無可比擬的優(yōu)勢，未來應用前景極佳。
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