Western blot的實驗技巧

       Western blot實驗看似簡單，但流程又很繁瑣。很多同學(xué)往往做了很長時間的實驗之后，卻得不到理想的實驗結(jié)果，甚是苦惱。其實，Western blot實驗是有很多注意點和實驗技巧的，小編今天給大家整理了一些非常關(guān)鍵的實驗事項：

蛋白提取

蛋白提取是實驗的第一步，也是最重要的一步，很多實驗結(jié)果不好往往是由于蛋白提取出現(xiàn)了問題（但是很多同學(xué)卻忽視了蛋白提取質(zhì)量對實驗結(jié)果的重要性）。以下幾個因素是經(jīng)常導(dǎo)致WB結(jié)果不理想的原因：

★ 蛋白提取的裂解液中，目的蛋白含量太低

一些蛋白在組織中的蛋白含量很低（例如轉(zhuǎn)錄因子等核蛋白，GPCR、CD分子等膜蛋白），如果提取蛋白的時候沒有做到富集，往往后續(xù)WB顯色的時候會導(dǎo)致背景很臟，甚至導(dǎo)致白板的出現(xiàn)。這時候需要專門的蛋白富集提取方法來提取蛋白，例如相對于全細(xì)胞或全組織裂解物來說，核表達(dá)蛋白在細(xì)胞核裂解物總蛋白中占有相當(dāng)大的比例，這樣凝膠條帶中可以載入更多的目的蛋白。另一個優(yōu)點是排除了雜質(zhì)成分潛在的交叉反應(yīng)。濃縮使信號最大化（例如檢測核蛋白要用核裂解物）。

如上圖結(jié)果所示，使用特定的蛋白提取試劑盒提取蛋白，可以有效的富集特定細(xì)胞組分，保證目的蛋白的上樣量。

注：實驗中使用GAPDH(M20006)分析細(xì)胞漿蛋白提取物，使用ATPase(T40109)分析細(xì)胞膜蛋白提取物，使用Histone(P30266)分析細(xì)胞核蛋白提取物。

膜蛋白產(chǎn)品提取試劑盒貨號：A10008，核蛋白產(chǎn)品提取試劑盒貨號：A10009

★ 蛋白提取后出現(xiàn)降解

在蛋白質(zhì)的提取過程中，蛋白酶在細(xì)胞或組織裂解后釋放，降解蛋白質(zhì)樣品，從而降低蛋白質(zhì)樣品的量。這樣往往導(dǎo)致后續(xù)實驗中檢測不到目的蛋白或蛋白降解帶明顯出現(xiàn)。為防止蛋白質(zhì)被蛋白酶所降解，要加入特異性的蛋白酶抑制劑來抑制蛋白酶活性。很多同學(xué)在實驗過程中也加入了蛋白酶抑制劑，但是為什么還會出現(xiàn)蛋白降解呢？主要原因是很多同學(xué)往往只加入了一種蛋白酶的抑制劑，但是蛋白酶是有非常多種類的，每一種蛋白酶均需要一種特定的蛋白酶抑制劑來抑制其蛋白酶活性。所以為了防止蛋白降解，需要加入各種蛋白酶抑制劑。

最方便的做法是購買現(xiàn)成的Cocktail形式的蛋白酶抑制劑，這種蛋白酶抑制劑是將常用的數(shù)種蛋白酶抑制劑混合到一起，制備成了即用型的試劑產(chǎn)品，用起來很是方便。

Abmart提供了一款Cocktail形式的蛋白酶抑制劑，可以有效地防止蛋白提取過程中的蛋白降解問題。A10004，200X 蛋白酶抑制劑復(fù)合物（200X Protease InhibitorCocktail）【同Sigma P1860】。

電泳轉(zhuǎn)膜

對于較大分子量的蛋白（大于100 kDa），電泳轉(zhuǎn)膜這個步驟是很容易出現(xiàn)問題的，主要是包括以下幾個方面：

1. 對于大蛋白而言，其在凝膠電泳分離遷移較慢，而從凝膠轉(zhuǎn)出也非常慢，因此對于這種大分子量蛋白應(yīng)該用低濃度的凝膠，8% 或更低，但因低濃度的膠非常易碎，所以操作時需十分小心。

2. 大蛋白易在凝膠里形成沉淀，從而影響轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜時在電轉(zhuǎn)移緩沖液加入SDS 至終濃度0.1%，避免出現(xiàn)這種情況。甲醇易使SDS 從蛋白上脫失，因此相應(yīng)降低甲醇的濃度至10% 或更低，以防止蛋白沉淀。

3. 降低電轉(zhuǎn)移緩沖液中甲醇的比例，這樣可以促進(jìn)凝膠的膨脹，更易于大蛋白的轉(zhuǎn)出。

4. 只有使用硝酸纖維素膜時，甲醇才是必需的。如果是PVDF膜，甲醇可以不必加入電轉(zhuǎn)移緩沖液中，但轉(zhuǎn)膜前PVDF 需用甲醇活化。

5. 選擇濕式，4℃ 轉(zhuǎn)膜過夜，以取代半干式轉(zhuǎn)膜。

這里，同學(xué)們需要注意：很多同學(xué)習(xí)慣使用預(yù)染marker判斷轉(zhuǎn)膜是否成功。該方法很是便捷，但是卻無法判斷每個泳道的轉(zhuǎn)膜情況和是否有氣泡污染。所以最好方法是使用“麗春紅染色QC轉(zhuǎn)膜質(zhì)量”。

為檢測轉(zhuǎn)膜是否成功，用TBST 洗膜，然后用麗春紅染色，室溫下震蕩5分鐘。然后將膜浸泡在水中直至水變清且出現(xiàn)蛋白條帶。觀察膜上的條帶是否清晰，各分子量條帶均可見，無明顯白色空斑（氣泡導(dǎo)致）。

用TBST 或水重復(fù)洗膜直至膜完全脫色，PVDF 膜需用甲醇活化后再用TBST 洗，然后進(jìn)行后續(xù)實驗操作。

10*麗春紅貯備液：2% 麗春紅S 溶于30% 三氯乙酸和30% 磺基水楊酸，震搖混勻。（或者購買現(xiàn)成的10*麗春紅貯備液，貨號: A10010）

一抗孵育/二抗孵育

★ 一抗稀釋液

為防止實驗結(jié)果的背景比較臟，最好使用封閉液來稀釋一抗，這樣可以避免一抗可能與封閉液有交叉反應(yīng)。

★ 使用錯二抗

有些抗體是小鼠抗體，有些抗體是兔子抗體，均需要使用對應(yīng)的二抗來顯色，用錯了就會導(dǎo)致白板。特別是很多時候希望一抗和內(nèi)參抗體同時孵育，使得目的蛋白檢測和內(nèi)參調(diào)平一步到位。但是很多時候是一抗是兔多抗，內(nèi)參是小鼠單抗，一旦大意疏忽，就會導(dǎo)致實驗出錯。

Abmart推出了一款“防錯二抗”（鼠兔通用二抗），一管抗體解決所有問題，讓實驗變得很輕松。

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