CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）系統(tǒng)是原核生物的獲得性免疫系統(tǒng)，用于抵御外源入侵的病毒或質(zhì)粒。2012 年，來自Ⅱ型CRISPR系的CRISPR相關(guān)蛋白Cas9被證明可以在體外由簡(jiǎn)單設(shè)計(jì)的向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA）引導(dǎo)識(shí)別并切割含PAM（protospacer adjacent motif）序列的靶標(biāo)雙鏈DNA ；快Cas9又被成功應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組編輯。從那時(shí)起，CRISPR技術(shù)在基因組編輯領(lǐng)域受到了高度重視和廣泛應(yīng)用，也連續(xù)多年被Science雜志列為“年度十大技術(shù)破”。此外，CRISPR技術(shù)也被用于基因表達(dá)調(diào)控、高通量篩選、表觀遺傳學(xué)工程等領(lǐng)域。

      核酸檢測(cè)是病原菌檢測(cè)、疾病檢測(cè)、用藥指導(dǎo)等領(lǐng)域的重要技術(shù)。雖然，目前已經(jīng)開發(fā)出了許多核酸檢測(cè)的方法，但更快速、更廉價(jià)、更特異、更靈敏的技術(shù)仍然是不斷追求的目標(biāo)。CRISPR技術(shù)無疑提供了核酸檢測(cè)領(lǐng)域的新的解決方案，特別是基于Cas13和Cas12的反式切割（trans cleavage）或稱附帶切割（collateral cleavage）的活性開發(fā)的檢測(cè)技術(shù)被譽(yù)為“下一代分子快速診斷技術(shù)”。

基于Cas9 的檢測(cè)系統(tǒng)

      通過將Cas9的特異性切割特征和核酸擴(kuò)增體系結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)針對(duì)靶標(biāo)核酸的檢測(cè)，從而可實(shí)現(xiàn)SNP（single nucleotide polymorphism）的區(qū)分和病原體表型的分型。目前，有至少3種結(jié)合PCR擴(kuò)增的檢測(cè)方法被成功開發(fā)，分別為ctPCR（CRISPR-typing PCR）、CARP（Cas9/sgRNAs-associated reverse PCR）和基于CRISPR/Cas9切割活性的PCR。上述方法都是在PCR擴(kuò)增之前利用Cas9切割完全匹配的靶標(biāo)序列，而不切割產(chǎn)生突變的靶標(biāo)序列，從而影響PCR的擴(kuò)增結(jié)果，進(jìn)而區(qū)分諸如高危人乳頭瘤病毒（HPV）亞型HPV16和HPV18或是用來檢測(cè)低頻突變。

      對(duì)于偏遠(yuǎn)地區(qū)的野外檢測(cè)，常常需要無需精確循環(huán)控溫儀器的等溫?cái)U(kuò)增方法。結(jié)合NASBA（nucleic acid sequence based amplifi cation）介導(dǎo)靶標(biāo)序列擴(kuò)增，將Cas9、T7轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)與基于紙質(zhì)載體的等溫toehold生物傳感系統(tǒng)相結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)通過肉眼觀察來檢測(cè)寨卡病毒的基因分型。此外，CAS-EXPAR（CRISPR/Cas9 triggered isothermal exponential amplification reaction）和CRISDA（CRISPR-Cas9-triggered nicking endonuclease mediated strand displacement amplifi cation method）方法，都使用了Cas9的切割與等溫?cái)U(kuò)增相結(jié)合的策略，以達(dá)到針對(duì)靶標(biāo)序列的單堿基分辨率。

基于反式切割活性的核酸檢測(cè)

單鏈RNA反式切割活性的核酸檢測(cè)系統(tǒng)

      Cas13a 是RNA引導(dǎo)的RNA切割酶，屬于Ⅵ型CRISPR-Cas 蛋白。在gRNA的引導(dǎo)下，Cas13a 結(jié)合單鏈靶標(biāo)RNA后，除了能將靶標(biāo)RNA切斷之外，還可激發(fā)Cas13a的“反式切割”活性，即Cas13a隨機(jī)切割體系中其他的單鏈RNA分子?；贑as13a的該原理，研究人員開發(fā)了SHERLOCK（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing）的檢測(cè)系統(tǒng)。具體做法是利用RPA（recombinase polymerase amplification）或者RT-RPA等溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)將目標(biāo)模板擴(kuò)增為包含T7啟動(dòng)子的DNA模板，然后再利用T7轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)把DNA模板轉(zhuǎn)變?yōu)镃as13a可以直接結(jié)合的RNA靶標(biāo)；同時(shí)在體系中添加一端為熒光發(fā)光基團(tuán)、一端為熒光淬滅基團(tuán)的單鏈RNA報(bào)告分子；在Cas13a結(jié)合靶標(biāo)RNA后即觸發(fā)Cas13a隨機(jī)切割單鏈RNA探針的活性，從而產(chǎn)生游離的熒光發(fā)光基團(tuán)并發(fā)出可檢測(cè)的熒光。利用該方法，研究人員靈敏地檢測(cè)了各種DNA或RNA靶標(biāo)，包括寨卡病毒、 登革熱病毒、細(xì)菌分離株、抗性基因、人類DNA 基因型和癌癥突變等。之后不久， 第二代SHERLOCKv2 系統(tǒng)被成功開發(fā)，其使用4 種正交的CRISPR-Cas 蛋白來實(shí)現(xiàn)多重靶標(biāo)的檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上，為了適應(yīng)野外偏遠(yuǎn)地區(qū)的快速分子檢測(cè)，研究人員進(jìn)一步開發(fā)了HUDSON（heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases）方法來直接對(duì)人的體液進(jìn)行快速樣本處理，然后利用SHERLOCK 方法便在不到2h 內(nèi)直接從患者樣本中成功檢測(cè)出了登革熱病毒。

單鏈DNA反式切割活性的核酸檢測(cè)系統(tǒng)

       除Cas13蛋白外， 來自Ⅴ 型的CRISPR-Cas12a蛋白也被發(fā)現(xiàn)具有反式切割特性；但與Cas13不同，Cas12a靶向DNA模板并反式切割單鏈DNA（singlestranded DNA，ssDNA）利用Cas12a蛋白建立的核酸快速檢測(cè)方法的首次報(bào)導(dǎo)來自一篇2017 年提交的中國(guó)專利；后來，同一研究組在線發(fā)表了兩篇研究論文，詳細(xì)描述了Cas12a的切割特征和基于Cas12a的核酸檢測(cè)方法，稱為HOLMES（onehour low-cost multipurpose highly efficient system）。同一時(shí)期，美國(guó)一個(gè)研究組也發(fā)布了基于Cas12a的、類似的核酸檢測(cè)方法，名為DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR transreporter）。無論是HOLMES還是DETECTR都展示了非常高效、靈敏和特異的檢測(cè)活性，可以用來快速檢測(cè)DNA病毒、RNA病毒和人的SNP。

本產(chǎn)品僅限科研研究不做臨床診斷