信使核糖核酸（mRNA）的5’端帽子結(jié)構(gòu)（Five-prime cap）（m7GpppN）是在 1970 年代被發(fā)現(xiàn)的，它的存在賦予了mRNA穩(wěn)定性并使其能夠有效翻譯。隨著COVID-19在全球肆虐，mRNA治療成為生物醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域中的”新星“，我們對(duì)mRNA 5’端帽子結(jié)構(gòu)的生物功能及其應(yīng)用有了更深入地探索。

      在真核細(xì)胞中，除了識(shí)別蛋白質(zhì)合成的起始之外，5’端帽子結(jié)構(gòu)還充當(dāng)從5’到3’外切核酸酶切割的保護(hù)基團(tuán)，同時(shí)也是募集蛋白質(zhì)因子以進(jìn)行前體mRNA 剪接、聚腺苷酸化和核輸出的唯一標(biāo)識(shí)符，它也充當(dāng)募集起始因子的錨點(diǎn)。甚至，在病毒與固有免a疫的博弈中5’端帽子結(jié)構(gòu)也極為重要。因?yàn)楣逃忻庖呦到y(tǒng)對(duì)沒(méi)有 5 ’端帽子結(jié)構(gòu)的 RNA 具有較高的敏銳度，因此很多病毒進(jìn)化出了豐富多樣的加帽策略。而對(duì)這些病毒mRNA的加帽機(jī)制研究，已拓展出諸如高效體外RNA 加帽系統(tǒng)和自擴(kuò)增 mRNA 技術(shù)，大大促進(jìn)了科研型與治療型 mRNA 的大規(guī)模生產(chǎn)。另外，RNA 加帽酶的應(yīng)用也使微生物轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序和量化成為可能。

圖1. mRNA的分子生物學(xué)結(jié)構(gòu)

        mRNA是指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的模板，是一種遺傳物質(zhì)的臨時(shí)副本，具有拷貝少、壽命短、修飾成分少的特點(diǎn)。成熟的真核生物mRNA的主體序列是編碼區(qū)（圖1），上游5’ 側(cè)和下游3’側(cè)的非編碼區(qū)分別包含帽子結(jié)構(gòu)與poly(A)尾結(jié)構(gòu)（圖2）。

       真核生物的mRNA加帽過(guò)程需要多種加帽酶的參與。如圖3所示，RNA三磷酸酶（TPase）從5’-三磷酸中去除 γ-磷酸，生成 5’-二磷酸 RNA（反應(yīng) 1）。RNA 鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)移酶（GTase）通過(guò)賴氨酸-GMP 共價(jià)中間體將 GMP 基團(tuán)從 GTP 轉(zhuǎn)移到 5’-二磷酸（反應(yīng) 2.1 和 2.2）。嘌呤-N7 甲基轉(zhuǎn)移酶（鳥(niǎo)嘌呤-N7 MTase）在鳥(niǎo)嘌呤帽的N7胺上添加一個(gè)甲基，形成基本帽結(jié)構(gòu)（Cap0）（反應(yīng) 3）。

      此外，m7G 特異性 2’O-甲基轉(zhuǎn)移酶（mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase）還可將核糖2’O位置的核糖核苷酸甲基化生成Cap1結(jié)構(gòu)（反應(yīng) 4）。最近的研究表明，Cap1不僅與翻譯起始有關(guān)，在針對(duì)外源RNA的先天免疫系統(tǒng)中，還可作為自身RNA的標(biāo)志。

      5’端帽子結(jié)構(gòu)對(duì)mRNA的質(zhì)量控制有著至關(guān)重要的作用。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，已經(jīng)報(bào)道存在一種具有脫帽酶、焦磷酸水解酶和 5’ 到 3’核酸酶活性的三功能蛋白DXO/Dom3Z。該酶特異性地將未甲基化的帽子結(jié)構(gòu)（GpppN）進(jìn)行脫帽處理并將其降解為5’-單磷酸RNA，從而達(dá)到質(zhì)量控制的目的。

      5’端帽子結(jié)構(gòu)有助于調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成。早期認(rèn)為RNA加帽只發(fā)生在細(xì)胞核中，已有報(bào)道在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和錐蟲(chóng)的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了RNA 加帽。真核細(xì)胞在P-小體中以信使核糖核蛋白（mRNP）的形式維持未加帽結(jié)構(gòu)的mRNA 細(xì)胞質(zhì)池，在那里可以發(fā)生 mRNA 的儲(chǔ)存、去腺苷酸化和脫帽。P-小體中未加帽的mRNA可以重新進(jìn)入多核糖體（polysome）并被翻譯。細(xì)胞質(zhì)重新加帽子結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)可能代表了一種新的mRNA 失活-再激活機(jī)制，有助于調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成。

      鑒于RNA帽子結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)翻譯和固有免疫中有重要作用，病毒已經(jīng)進(jìn)化出RNA添加帽子結(jié)構(gòu)的生物學(xué)系統(tǒng)，用于合成病毒蛋白質(zhì)和逃避宿主細(xì)胞的固有免疫系統(tǒng)。由于大部分細(xì)胞中RNA加帽的場(chǎng)所在細(xì)胞核中，因此在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制的病毒會(huì)產(chǎn)生自己的RNA帽子結(jié)構(gòu)。它們是通過(guò)合成自己的RNA帽子結(jié)構(gòu)或直接從宿主的mRNA中奪取。

      一些病毒加帽酶整合了RNA加帽所有必要酶活性（多功能加帽酶），以在單個(gè)多肽中生成Cap0或Cap1。痘病毒加帽酶和藍(lán)舌病病毒加帽酶就是這樣兩個(gè)例子，它們的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析（圖4）：



       痘病毒加帽酶結(jié)構(gòu)和生化數(shù)據(jù)表明，D12與鳥(niǎo)嘌呤-N7 MTase 結(jié)構(gòu)域的相互作用會(huì)誘導(dǎo)有效催化所需的構(gòu)象變化。痘病毒加帽酶的三種酶活性從N-端到C-端按照TPase、GTase和鳥(niǎo)嘌呤-N7 MTase的順序整齊排列為離散模塊。藍(lán)舌病毒加帽酶VP4 整合了所有4種酶活性以生成Cap1結(jié)構(gòu)。

      病毒除了合成自身的帽子結(jié)構(gòu)，也存在奪取宿主mRNA帽子結(jié)構(gòu)的情況（圖5），在流感病毒（（-）ssRNA）中，依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）是三種蛋白質(zhì)的復(fù)合物：聚合酶基礎(chǔ)蛋白1（PB1）、聚合酶基礎(chǔ)蛋白2（PB2）和聚合酶酸性蛋白（PA）。

      在細(xì)胞核中組裝后，PB2 亞基與宿主RNA 的帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合。PA的核酸內(nèi)切酶將切割宿主mRNA的含帽子結(jié)構(gòu)在內(nèi)的10-15個(gè)核苷酸，然后將其用于病毒的mRNA轉(zhuǎn)錄上。在酵母全病毒中Gag蛋白從宿主RNA上切割 m7GMP 基團(tuán)并形成組氨酰-m7GMP共價(jià)中間體。然后將 m7GMP 基團(tuán)共轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)移到病毒轉(zhuǎn)錄本的 5’-二磷酸上。該過(guò)程與經(jīng)典 GTase活性的相似性表明全病毒帽子結(jié)構(gòu)與真核生物加帽機(jī)制之間存在進(jìn)化聯(lián)系。



病毒由于其特殊的添加mRNA帽子的方式而得到關(guān)注，人們也發(fā)現(xiàn)其RNA加帽酶具廣泛的應(yīng)用價(jià)值：

1. 外源mRNA技術(shù)
作為蛋白質(zhì)合成的模板，將mRNA導(dǎo)入細(xì)胞是驅(qū)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)靶蛋白表達(dá)最直觀的方式。外源性mRNA在干細(xì)胞重編程、疫苗接種和治療性蛋白質(zhì)的表達(dá)中起到舉足輕重的地位。
2. 功能性mRNA的酶促合成
為避免攜帶動(dòng)物或病毒材料，最好在體外使用無(wú)動(dòng)物來(lái)源材料以酶促方式制造治療性RNA。通常，DNA依賴性RNA聚合酶將含有啟動(dòng)子的DNA模板轉(zhuǎn)錄成RNA。RNA的酶促加帽通常使用痘病毒加帽酶進(jìn)行，允許對(duì)RNA進(jìn)行完全加帽，產(chǎn)生帶有Cap0的RNA。
在固有免疫反應(yīng)最小化的應(yīng)用中，可以使用帽特異性2’O-甲基轉(zhuǎn)移酶將Cap0結(jié)構(gòu)進(jìn)一步修飾為Cap1。在轉(zhuǎn)錄中分別使用m5CTP 和假尿苷三磷酸代替CTP和UTP已被證明可以減少TLR誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
3. mRNA疫苗
與傳統(tǒng)的減毒活完整生物體相比，通過(guò)mRNA接種進(jìn)行疫苗接種具有許多積極的屬性。mRNA疫苗不僅不會(huì)對(duì)載體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，是可以同時(shí)刺激固有免疫和體液免疫的有效手段。制造很簡(jiǎn)單，一旦獲得致病因子的基因組序列，就可以迅速做出反應(yīng)。與DNA疫苗不同，抗原產(chǎn)生的反應(yīng)時(shí)間更快、更有效，因?yàn)閙RNA疫苗可以直接在細(xì)胞質(zhì)中翻譯。也無(wú)需擔(dān)心潛在的基因組整合。
4. 自擴(kuò)增mRNA
利用甲病毒的RNA轉(zhuǎn)錄加帽裝置，已開(kāi)發(fā)出一種自擴(kuò)增mRNA 技術(shù)作為疫苗接種的原位基因表達(dá)載體。甲病毒有一個(gè)（+）ssRNA 基因組，編碼非結(jié)構(gòu)性前體蛋白nsp1-4，用于RNA依賴性RNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和加帽，以及兩個(gè)衣殼蛋白E2和E1。
通過(guò)用目標(biāo)基因替換衣殼蛋白基因，加帽和聚腺苷酸化的自擴(kuò)增RNA 構(gòu)建體在引發(fā)免疫反應(yīng)方面比通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)mRNA接種疫苗更有效，并且已經(jīng)在動(dòng)物模型中證明有效。
5. Cappable-Seq RNA測(cè)序
痘病毒加帽酶能夠使用3’修飾的GTP為RNA添加帽子結(jié)構(gòu)。從而出現(xiàn)了一種基于這種功能的從生物樣品中富集和測(cè)定5’-三磷酸RNA 種類的新方法。稱為Cappable-seq，痘病毒加帽酶用于使用3’-脫硫生物素GTP 將生物樣品中RNA的5’-三磷酸或二磷酸末端加帽。然后可以對(duì)脫硫生物素化的加帽RNA進(jìn)行富集和深度測(cè)序。
Cappable-seq實(shí)現(xiàn)了50倍于初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的富集，并在大腸桿菌中以單堿基分辨率在全基因組范圍內(nèi)識(shí)別了以前未報(bào)告的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）。該方法還被應(yīng)用于從小鼠盲腸樣本中鑒定微生物組轉(zhuǎn)錄組，并首次在微生物組中鑒定出TSS。

目前現(xiàn)有的加帽方法:

1.酶學(xué)法mRNA加帽
牛痘病毒加帽酶將 7-甲基鳥(niǎo)苷帽結(jié)構(gòu)（m7Gppp，Cap0）加到 RNA 的 5′ 末端。在真核生物中，該結(jié)構(gòu)與 mRNA 的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯密切相關(guān)。這種系統(tǒng)通常含三種酶（RNA 三磷酸酶，鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)移酶，鳥(niǎo)嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶）；都為加入完整 Cap 0 結(jié)構(gòu) m7Gppp5’N 所必需。近岸蛋白生產(chǎn)的加帽酶可用于 T7 RNA Polymerase, GMP Grade（GMP-E121，Novoprotein）反應(yīng)產(chǎn)生的 RNA 的加帽反應(yīng)，加帽反應(yīng)在一小時(shí)之內(nèi)完成，加帽效率接近 100％，并且所有帽結(jié)構(gòu)均以正確的方向添加，這與共轉(zhuǎn)錄法添加帽類似物不同。

2.帽結(jié)構(gòu)類似物共轉(zhuǎn)錄加帽
抗-反帽結(jié)構(gòu)類似物（ARCA）[抗-反帽結(jié)構(gòu)類似物 3’-O-Me-m7G（5’） ppp（5’）G] 是用于共轉(zhuǎn)錄加帽的首選帽結(jié)構(gòu)類似物。由于 ARCA 進(jìn)行共轉(zhuǎn)錄時(shí)為定向整合，N7-甲基鳥(niǎo)苷位于 [m7G（5’）pppG-RNA] 末端，因此能夠產(chǎn)生 100％ 可翻譯的帶帽轉(zhuǎn)錄本。

而標(biāo)準(zhǔn)帽結(jié)構(gòu)類似物 [標(biāo)準(zhǔn)帽結(jié)構(gòu)類似物 m7G（5’）ppp（5’） G] 能夠以兩種方向整合[m7G（5’）pppG-RNA]或[G（5 ’） pppm7G-RNA]，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄本為混合物。如果帽結(jié)構(gòu)類似物以錯(cuò)誤的方向摻入 mRNA 則無(wú)法有效翻譯，從而導(dǎo)致目標(biāo)蛋白產(chǎn)量低。如果 RNA 產(chǎn)物為 5’-加帽和 5’-三磷酸的混合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，則需要將其進(jìn)行純化或使用磷酸酶處理，以避免 5’-三磷酸 RNA 產(chǎn)生的免疫原性。

3.Cap 1 修飾
已有研究表明 cap 1 結(jié)構(gòu)能夠增強(qiáng) mRNA 的翻譯效率，從而提高 mRNA 在轉(zhuǎn)染和顯微注射實(shí)驗(yàn)中的表達(dá)。以近岸蛋白為例，其Cap 1 Capping System可利用 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體，使加帽的 RNA（cap 0）甲基化，獲得 cap 1 結(jié)構(gòu)。

綜上所述，mRNA的帽子結(jié)構(gòu)與RNA質(zhì)量控制和機(jī)體固有免疫有重要聯(lián)系，與此同時(shí)，與加帽有關(guān)的病毒加帽相關(guān)酶類也得到人們重視。加帽酶在外源mRNA技術(shù)、功能性mRNA的酶促合成、mRNA疫苗、自擴(kuò)增mRNA和Cappable-Seq RNA測(cè)序方面都有較好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：AnandRamanathan, G. Brett Robb, Siu-Hong Chan, mRNA capping: biological functions and applications, Nucleic Acids Research, Volume 44, Issue 16, 19 September 2016, Pages 7511–7526, https://doi.org/10.1093/nar/gkw551
文章來(lái)源：RNAScript

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貨號(hào)	名稱	規(guī)格
GMP-M062-01A	Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade	500U
GMP-M072-01A	mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase, GMP Grade	2500U
GMP -S062	SAM (32mM), GMP Grade	0.5ml
GMP-M062-01A	Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade	500U
M062-YH01-01A	Vaccinia Capping System	500U