腺相關(guān)病毒(AAV)具有無致病性、高效的長(zhǎng)期基因表達(dá)、易于基因操作以及免疫反應(yīng)低(或在許多情況下缺乏)的特點(diǎn)，這一系列特性使其成為用于基因治療遞送的重要載體。然而，AAV制造過程復(fù)雜，限制因素多，已成為整個(gè)行業(yè)的瓶頸。

      由于存在圍繞貼壁培養(yǎng)放大的復(fù)雜性和勞動(dòng)密集型問題，因此一些公司在策略上決定使用懸浮培養(yǎng)而不是貼壁培養(yǎng)來生產(chǎn)病毒載體。

由貼壁培養(yǎng)過渡到放大規(guī)模的懸浮培養(yǎng)的過程需要適應(yīng)細(xì)胞，這可能需要幾個(gè)月的時(shí)間，而且并不總是成功。這個(gè)過程可能會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)力下降、生長(zhǎng)速度降低以及潛在的遺傳不穩(wěn)定，細(xì)胞基因表達(dá)模式的改變也很常見。在這種情況下，盡早使用懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)病毒載體的策略，有望大大簡(jiǎn)化工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)。

      值得注意的是，大規(guī)模生產(chǎn)工藝是保證高產(chǎn)量和可靠的AAV病毒載體商業(yè)化制造過程的關(guān)鍵，這依賴于穩(wěn)健的大規(guī)模瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過程。專業(yè)且富有實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)的轉(zhuǎn)染試劑供應(yīng)商可以為高效穩(wěn)健的轉(zhuǎn)染過程提供重要支持，Polyplus-transfection是第一家面向基因和細(xì)胞治療市場(chǎng)的GMP轉(zhuǎn)染試劑供應(yīng)商，也是唯一一家從最初的工藝開發(fā)到商業(yè)化向病毒制造商提供廣泛的技術(shù)和監(jiān)管支持的轉(zhuǎn)染試劑供應(yīng)商。2018年，該公司推出了首個(gè)用于生產(chǎn)治療性病毒的GMP兼容轉(zhuǎn)染試劑（PEIpro-GMP）。

      近期，Polyplus-transfection公司推出了一款基于化學(xué)成分且不含動(dòng)物源的陽離子納米技術(shù)的轉(zhuǎn)染試劑FectoVIR-AAV，專為懸浮細(xì)胞體系規(guī)模化生產(chǎn)AAV而開發(fā)，可用在基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域。

      FectoVIR-AAV適用于各種規(guī)格的搖瓶、轉(zhuǎn)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)袋和生物反應(yīng)器中無血清懸浮培養(yǎng)的DNA轉(zhuǎn)染，且兼容在細(xì)胞培養(yǎng)過程中抗生素的使用。

      FectoVIR-AAV可以解決現(xiàn)有轉(zhuǎn)染試劑在AAV生產(chǎn)過程中的局限性，以下部分將展開描述現(xiàn)有挑戰(zhàn)，以及FectoVIR-AAV對(duì)比其他轉(zhuǎn)染試劑的優(yōu)勢(shì)。

高性能：懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中rAAV的高產(chǎn)量

      FectoVIR-AAV轉(zhuǎn)染試劑是一種新型的基于化學(xué)物質(zhì)的不含動(dòng)物成分的轉(zhuǎn)染試劑，其設(shè)計(jì)目的是解決當(dāng)前rAAV病毒載體產(chǎn)量和工業(yè)可擴(kuò)展性方面的限制。

與PEIpro轉(zhuǎn)染試劑和其他競(jìng)品相比，FectoVIR-AAV轉(zhuǎn)染試劑在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中生產(chǎn)rAAV病毒載體方面表現(xiàn)出高性能。FectoVIR-AAV可重復(fù)性地大幅提高AAV的產(chǎn)量，與其他競(jìng)品(PEImax)相比，增幅高達(dá)10倍(如下圖)。

▲ 與競(jìng)品相比，FectoVIR-AAV可提高病毒基因組的生產(chǎn)效率和包裝效率，從而使功能性rAAV-2-GFP的產(chǎn)量提高10倍。

      可擴(kuò)展性：專為小規(guī)模到大規(guī)模生產(chǎn)而開發(fā)

可擴(kuò)展性是保證高產(chǎn)量和可靠的rAAV病毒載體生產(chǎn)過程商業(yè)化的必要條件。大規(guī)模rAAV病毒載體的制造依賴于一個(gè)穩(wěn)健的大規(guī)模瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過程。大規(guī)模瞬態(tài)轉(zhuǎn)染意味著需要在給定的時(shí)間框架內(nèi)制備大量轉(zhuǎn)染復(fù)合物并將其添加到懸浮液細(xì)胞中，以便高效轉(zhuǎn)染。FectoVIR-AAV專門用于大規(guī)模轉(zhuǎn)染，可以解決AAV制造過程中體積和時(shí)間限制方面的局限性。

轉(zhuǎn)染復(fù)合物體積：

      通常，轉(zhuǎn)染復(fù)合體積占最終細(xì)胞培養(yǎng)體積的10％，這在擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致技術(shù)限制。FectoVIR-AAV經(jīng)過優(yōu)化，可將絡(luò)合量降低至1％，從而有助于制備用于大規(guī)模生產(chǎn)的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。例如，對(duì)于200 L的細(xì)胞懸液體積，轉(zhuǎn)染復(fù)合體積可以從20 L (10％)降至2 L (1％)進(jìn)行優(yōu)化。

▲ 優(yōu)化的FectoVIR-AAV轉(zhuǎn)染復(fù)合物制劑，可進(jìn)行大規(guī)模瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。

轉(zhuǎn)染孵育時(shí)間：

      大規(guī)模瞬時(shí)轉(zhuǎn)染需要向懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物中添加更大體積的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，這意味著更長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移時(shí)間。使用FectoVIR-AAV，轉(zhuǎn)移時(shí)間不再是可以導(dǎo)致病毒滴度產(chǎn)量變化的限制因素。FectoVIR-AAV轉(zhuǎn)染復(fù)合物顯示出極大的穩(wěn)定性：將FectoVIR-AAV轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒DNA混合后，可以在6h內(nèi)可靠地將轉(zhuǎn)染復(fù)合物添加到細(xì)胞中，而rAAV滴度產(chǎn)量沒有明顯變化。

▲ FectoVIR-AAV/ DNA復(fù)合物的長(zhǎng)期穩(wěn)定性可確保工業(yè)規(guī)模的可靠滴定度。

靈活性：與各種商業(yè)培養(yǎng)基和細(xì)胞系統(tǒng)兼容

      合成細(xì)胞培養(yǎng)基的選擇特定于每個(gè)rAAV制造平臺(tái)。FectoVIR-AAV/DNA復(fù)合物的效率已在不同的市售合成復(fù)合介質(zhì)中進(jìn)行了全面測(cè)試，并且效價(jià)收率在各種測(cè)試介質(zhì)中的變化很小。

▲ FectoVIR-AAV與幾種可用于懸浮HEK-293細(xì)胞的合 成培養(yǎng)基兼容。

      總的來說，與基因/細(xì)胞治療金標(biāo)準(zhǔn)領(lǐng)域的金標(biāo)準(zhǔn)PEIpro相比，FectoVIR -AAV可獲得其2-3倍高感染滴度的病毒載體，且整個(gè)操作過程增加了更多的彈性。轉(zhuǎn)染時(shí)復(fù)合物的穩(wěn)定性可延長(zhǎng)至6小時(shí)，復(fù)合物工作體積由10%減至1%，此外，DNA的用量也可減少25%，在減少成本的同時(shí)給大規(guī)模瞬時(shí)轉(zhuǎn)染提供了諸多便利。GMP級(jí)用于臨床試驗(yàn)的產(chǎn)品也已經(jīng)上市。

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