猴痘病毒，這個(gè)天花病毒的神秘近親，正在全球范圍內(nèi)肆虐。 迄今已有近8萬(wàn)人淪陷于其威脅之下。為了及時(shí)上報(bào)疑似病例并掌握疫情的動(dòng)態(tài)，快速而精確地檢測(cè)猴痘病毒成為每個(gè)衛(wèi)生部門的當(dāng)務(wù)之急。

2022年9月，中國(guó)科學(xué)院上海巴斯德研究所研究員Nicolas Berthet、王頌基等在 Viruses 上發(fā)表了一篇題為“Development and Characterization of Recombinase-Based Isothermal Amplification Assays (RPA/RAA) for the Rapid Detection of Monkeypox Virus”的研究，他們成功研發(fā)出三種可以在20至30分鐘內(nèi)快速、簡(jiǎn)便、直觀地診斷猴痘病毒的方法。這些方法不僅與現(xiàn)行的qPCR核酸檢測(cè)方法結(jié)果高度一致，而且更加迅速、直接。猴痘是一種臨床癥狀與天花相似，但相對(duì)較溫和的疾病，其致死率約為1%—10%。雖然歷史上主要在中非與西非流行，但近些年來(lái)，猴痘病毒正日益成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)，促使人們深入研究它。MPXV核酸檢測(cè)對(duì)于監(jiān)測(cè)和診斷工作至關(guān)重要，有助于通過(guò)積極識(shí)別感染病例來(lái)減少病毒傳播。目前，用于診斷猴痘的方法主要包括病毒分離、電子顯微鏡和聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）等。MPXV檢測(cè)的黃金標(biāo)準(zhǔn)是real-time PCR，因?yàn)樗哂懈哽`敏度和特異性。然而，由于設(shè)備和技術(shù)限制，該方法在一些MPXV流行的資源匱乏地區(qū)并不總是可行的。因此，簡(jiǎn)單的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)對(duì)于快速、方便地診斷MPXV感染至關(guān)重要。

                                              圖1. 實(shí)時(shí) RPA 和 RPA-Cas12a 檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度

本研究中所報(bào)道的檢測(cè)方法是基于重組聚合酶對(duì)病毒基因組的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，并分別與CRISPR/Cas12、核酸外切酶以及橫向流動(dòng)試紙條相結(jié)合而開發(fā)的。研究人員使用三種檢測(cè)方法對(duì)19份提取自中非臨床樣本的DNA進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)檢測(cè)定量PCR的結(jié)果一致。

       此外，這些方法具有特異性，不會(huì)與其他正痘病毒（如痘苗病毒）發(fā)生交叉反應(yīng)。這些診斷方法的開發(fā)為MPXV快速檢測(cè)提供了新的、便捷的選項(xiàng)，將有助于控制和預(yù)防MPXV的流行。

                                                               圖2. RAA-LFS 檢測(cè)的靈敏度和特異性

                       圖3. 使用三種方法在臨床樣本中檢測(cè)MPXV，并與real-time PCR 進(jìn)行比較

利用real-time RPA和RAA-LFS進(jìn)行MPXV 檢測(cè)的結(jié)果與real-time PCR結(jié)果顯示出高度的一致性（100%），RPA-Cas12a則顯示出83.3%的一致性。在低濃度核酸擴(kuò)增過(guò)程中，將少量擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到新管中時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)局部快速擴(kuò)增，造成進(jìn)樣誤差，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度降低。因此在未來(lái)的研究中，有必要將RPA-Cas12a方法進(jìn)一步優(yōu)化為單管檢測(cè)，以提高靈敏度。

基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的等溫?cái)U(kuò)增測(cè)定技術(shù)（Isothermal Amplification Assays based on Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP）此前已用于MPXV檢測(cè)開發(fā)。盡管該檢測(cè)也不需要特定的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，但與nested PCR 的結(jié)果相比，該檢測(cè)僅具有72%的一致性，且需要大約60分鐘才能生成結(jié)果。此外，LAMP MPXV 檢測(cè)需要六對(duì)引物，但三種基于重組酶的擴(kuò)增檢測(cè)只需要一對(duì)引物和一個(gè)探針，從而簡(jiǎn)化了診斷設(shè)計(jì)。之前發(fā)表的針對(duì) G2R 基因的 MPXV-RPA 檢測(cè)結(jié)果與我們的real-time RPA 結(jié)果一致，但需要專門的儀器和訓(xùn)練有素的實(shí)驗(yàn)室工作人員，這限制了其在非專業(yè)人士家庭使用的實(shí)用性。

相比之下，RAA-LFS 更加用戶友好，因?yàn)槠洳僮骱?jiǎn)單，并且與其他基于試紙的檢測(cè)（例如 pH 或妊娠測(cè)試）相似，這使得在家自我檢測(cè)更加可行。

總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究成功地將RPA/RAA技術(shù)與CRISPR-Cas系統(tǒng)相結(jié)合，開創(chuàng)了一個(gè)快速、準(zhǔn)確、方便的猴痘病毒檢測(cè)平臺(tái)。這不僅為當(dāng)前的疫情檢測(cè)提供了強(qiáng)有力的支持，更為未來(lái)的防控工作打下了堅(jiān)實(shí)的基石。

原文鏈接：https://www.mdpi.com/1999-4915/14/10/2112

參考文獻(xiàn)：Mao L, Ying J, Selekon B, Gonofio E, Wang X, Nakoune E, Wong G, Berthet N. Development and Characterization of Recombinase-Based Isothermal Amplification Assays (RPA/RAA) for the Rapid Detection of Monkeypox Virus. Viruses. 2022 Sep 23;14(10):2112. doi: 10.3390/v14102112. PMID: 36298667; PMCID: PMC9611073.

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