CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）是一段成簇、規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列。其與CRISPR相關(guān)蛋白（CRISPR-associated protein, Cas）組成的CRISPR/Cas系統(tǒng)是廣泛存在于多數(shù)細菌和古細菌中的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。

CRISPR/Cas系統(tǒng)主要通過適應(yīng)，表達和干擾三個階段來介導細菌的免疫過程（見圖1，圖片來自Barrangou, R. and Marraffini, L. Molecular Cell .2014.）。首先，在適應(yīng)階段，與病毒或質(zhì)粒序列同源的DNA短片段會被整合到CRISPR的間隔區(qū)；在表達階段，CRISPR基因序列的一級轉(zhuǎn)錄本pre-crRNA產(chǎn)生，并被加工成crRNA，crRNA與病毒或質(zhì)粒的靶序列匹配；在干擾階段，crRNA將Cas蛋白引導至與間隔區(qū)匹配的病毒或質(zhì)粒處形成效應(yīng)復(fù)合物，并利用Cas蛋白切割靶序列。其中，PAM序列是crRNA引導Cas蛋白正確識別靶序列的必要條件。

                               圖1

法國科學家Emmanuelle Charpentier在對化膿性鏈球菌的研究中發(fā)現(xiàn)了tracrRNA，并且2011年開始與Jennifer Doudna合作。Doudna是一位經(jīng)驗豐富的生物化學家，對RNA有著豐富的知識。她們一起成功地在試管中再造了細菌的基因剪刀，并簡化了剪刀的分子組成，使其更容易使用。兩個人因為發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)而獲得2020年諾貝爾化學獎。其實還有一些生物學家對基因編輯技術(shù)做出了很多貢獻，例如華人科學家張鋒首次證明CRISPR基因編輯可用于真核生物中。

之后大家繼續(xù)思考，既然crRNA可以引導Cas蛋白特異性識別靶序列，那CRISPR技術(shù)是否也可以應(yīng)用于核酸檢測中？答案是肯定的。隨著對CRISPR/Cas系統(tǒng)研究的不斷深入，Cas蛋白的特點及功能活性被逐漸認識并應(yīng)用，并且發(fā)現(xiàn)了更多的Cas蛋白，Cas12a、Cas13a等被定義并命名。表1中列出用于分子診斷的CRISPR/Cas系統(tǒng)及其特點。其中可以看到，Cas12a主要靶向單鏈或雙鏈DNA，而Cas13a可以直接靶向RNA。

                               表1

2018年，Chen等研究發(fā)現(xiàn)當CRISPR/Cas12a蛋白以序列特異性的方式切割dsDNA時，會誘發(fā)強烈的、非特異性ssDNA 的反式切割。作者利用Cas12a 這一附屬切割活性開發(fā)了一種準確快速的檢測方法。該檢測方法將Cas12a 與等溫擴增相結(jié)合，命名為DETECTR (DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter)，并實現(xiàn)患者樣品中人乳頭瘤病毒(HPV)高靈敏檢測。

從樣本中提取HPV的DNA，通過重組聚合酶等溫擴增對DNA進行擴增，再將Cas12a-crRNA復(fù)合物和標記有熒光淬滅的單鏈DNA探針加入反應(yīng)體系。當Cas12a-crRNA復(fù)合物特異性結(jié)合并切割HPV的DNA時，激活Cas12a的非特異反式切割，即對單鏈DNA探針進行切割，ssDNA熒光基團在被切割后產(chǎn)生熒光信號并完成對樣本中HPV DNA的特異性檢測。DETECTR可以對樣本中HPV16和HPV18進行準確檢測，相關(guān)原理示意圖見圖2。對25個樣本進行DETECTR檢測結(jié)果與普通PCR檢測進行對比，結(jié)果完全符合。

                      圖2

LwCas13a是第一個被用于核酸檢測中的Cas13a蛋白。Gootenberg等開發(fā)的基于Cas13a蛋白的檢測技術(shù)與等溫擴增技術(shù)結(jié)合，既可以檢測DNA靶標，也可以檢測RNA靶標。該技術(shù)被命名為SHERLOCK (Specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking)。檢測原理如圖3-a，由于Cas13a識別RNA靶標，所以RPA擴增后需要將產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄為RNA，后面的過程與DETECTR相似，Cas13a-crRNA特異結(jié)合RNA靶標后，Cas13a的非特異性反式切割活性被激活，對周圍的熒光探針進行切割從而發(fā)出熒光進行檢測。

2018年Gootenberg等對SHERLOCK技術(shù)進行升級，可以實現(xiàn)在單個反應(yīng)中檢測3 個ssRNA 靶標和1 個dsDNA靶標。研究人員對17 種CRISPR/Cas13a 和/Cas13b 酶進行了生化鑒定，選擇了3 種具有不同切割偏好的Cas13 蛋白(LwaCas13a、PsmCas13b 和CcaCas13b)與Cas12a 和RPA結(jié)合使用，每一種擴增的核酸靶標與對應(yīng)的Cas-crRNA 相結(jié)合，可激活對應(yīng)Cas蛋白的活性而切割其對應(yīng)的特異性底物，從而產(chǎn)生多種不同的熒光響應(yīng)，實現(xiàn)對不同靶標的檢測。相關(guān)原理見圖3-b。

                                    圖3

但是根據(jù)上面的應(yīng)用可以看出，CRISPR/Cas技術(shù)通常需要與等溫擴增等技術(shù)一起使用才能完成檢測，需要RPA對目標靶標擴增后，CRISPR/Cas主要發(fā)揮的是特異性檢測的作用，是否可以不經(jīng)RPA等技術(shù)擴增而直接利用CRISPR技術(shù)進行核酸檢測呢？很多學者也在這方面進行了各種探索。

Hajian等在2019年開發(fā)一種CRISPR芯片，該芯片材質(zhì)基底為石墨烯，利用場效應(yīng)晶體管與CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)合來檢測是否有目標序列的存在。石墨烯芯片上預(yù)制許多CRISPR/dCas9分子復(fù)合物。其中dRNP復(fù)合體可以解旋雙螺旋DNA，并且掃描整條DNA鏈，如果發(fā)現(xiàn)目標序列，dRNP復(fù)合體就可以調(diào)控場效應(yīng)晶體管來輸出電信號完成檢測。但是整個芯片的檢測成本較高。相關(guān)示意圖見圖4.

                                      圖4

2019年，Dai等通過探索Cas12a（cpf1）的反式剪切活性，想要開發(fā)一種通用的電化學傳感器。如圖5所示，Cas12a既有crRNA介導的特異性的順式剪切（cis-cleavage），也有非特異性的反式剪切活性（trans-cleavage）。圖5B中結(jié)合有亞甲基藍燃料的非特異的單鏈DNA報告分子被固定在金電極上。如果存在目標分子，Cas12a-crRNA就會介導對非特異ssDNA報告分子的反式剪切，產(chǎn)生較低的電化學信號；而如果沒有目標分子存在，Cas12a-crRNA不會激活其反式剪切活性，報告分子不會被切割，就會產(chǎn)生比較高的電化學信號，以此來判斷是否存在目標序列。

                                                                              圖5

CRISPR技術(shù)在核酸檢測中優(yōu)點主要有：

1）對單堿基突變有很高的分辨率；

2）更高的特異性和靈敏度；

3）陸續(xù)發(fā)現(xiàn)新的更有價值的Cas蛋白，可以更特異以及準確的進行分子檢測。

但是同時也有相應(yīng)的局限性：

1）設(shè)計時在3’端需要合適的PAM序列，PAM序列使crRNA引導Cas蛋白正確識別靶序列的必要條件；

2）目前在多重檢測中還有許多限制；

3）目前大部分都是與RPA等擴增技術(shù)聯(lián)合使用，但是擴增也可能會引入誤差，同時也有污染的風險。

CRISPR/Cas技術(shù)在核酸檢測中發(fā)揮了重要作用，為核酸檢測提供了新的思路。未來的研發(fā)方向主要是更加流程化，減少中間的操作步驟，使得檢測更加快速和便捷。隨著基于CRISPR/Cas技術(shù)的核酸檢測平臺的不斷發(fā)展，未來在分子診斷方面將發(fā)揮更重要的作用。

參考文獻

1.周桓等，Acta Microbiologica Sinica，2021,61(12):3856-3869.

2.Chen, et al. Science. 2018; 360(6387):436-439.

3.Gootenberg, et al. Science. 2017;356(6336):438-442.

4.Gootenberg, et al. Science. 2018; 360: 439-444.

5.Liu, et al. Lab Chip, 2023, 23, 1467–1492.

6.Hajian, et al. Nat Biomed Eng. 2019; 3(6): 427-437.

7.Dai, et al. Angew Chem Int Ed Engl. 2019; 58(48): 17399-17405.

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