常見問題 (Frequently asked questions) :

一、產(chǎn)品如何保存?

答復:本品以凍干粉形式提供，收到產(chǎn)品需2-8°C干燥保存。本品置于30°C，3個月酶活力損失約70%。本品溶于緩沖液配制成儲存液后，短期置于2-8°C保存，約2周穩(wěn)定。長期請置于-20°C保存，約數(shù)月穩(wěn)定。

二、凍干粉如何溶解?

答復: 本品易溶于水。建議用1/15M phosphate buffer (pH 7.5) 溶解，或用自己實驗體系相關緩沖液來解。儲存液的制備方法比較多，主要根據(jù)自身的實驗體系，或參考文獻來操作。短期置于2-8°C保存，約2周穩(wěn)定。長期請置于-20°C保存，約數(shù)月穩(wěn)定

三、 如何制備無菌酶溶液?

答復: 若需要制備無菌酶溶液，請用除硝酸纖維素膜之外的0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌。

四、 酶的比活力是多少?

答復: Zymolyase-20T指的是酶的比活力約20，000 units/g (20 Ku/mg)，具體批次酶的比活力是有變化的，詳細請見產(chǎn)品標簽或質檢報告。

五、 Zymolyase適用于哪些菌株類型?

答復: 該酶的裂解譜(lytic spectrum) 包含以下菌屬: Ashbya (阿舒囊霉屬)，Candida (假絲酵母屬),Debaryomyces (德巴利 (氏) 酵母屬),Eremothecium(假囊酵母屬),Endomyces(內(nèi)抱霉),Hansenula(漢遜氏酵母),Hanseniaspora(泡漢遜酵母屬),Kloeckera(克勒克酵母屬),kuyveromyces (克維酵母屬),Lipomyces(油脂酵母屬),Metschnikowia(梅奇酵母屬),Pichia(畢赤酵母屬),Pullularia(芽霉菌屬),Torulopsis(球擬酵母菌),Saccharomyces(酵母屬),Saccharomycopsis(復膜酵母菌屬),Saccharomycodes(類酵母屬),Schwanniomyces(許旺酵母菌屬)，等等。其他未羅列在內(nèi)的菌屬請查閱文獻或和我司聯(lián)系是否有相關應用數(shù)據(jù)

六、 Zymolyase適用于絲狀真菌嗎?

答復: 該酶主要用于酵母細胞壁的裂解，對于絲狀真菌，雖然與酵母細胞壁在結構上有很多相似，但裂解效果因菌株類型有差異。建議用復合酶的形式來特異裂解絲狀真菌，或選用我司提供的真菌溶壁酶。

七、酶的工作濃度一般是多少?

答復：不同的酵母菌株對酶的敏感性會有差異，請參閱文獻或根據(jù)實際的裂解經(jīng)驗來設定合適的工作濃度。操作方法可參考下方流程。

操作步驟(僅作參考，實際應用可做適當調(diào)整)

一、Zymolyase-20T儲存液制備

此配制方法針對以下步驟來設置，也可以適用其他適當?shù)娜軇┤?/span>1/15M phosphate buffer(pH 7.5)、10mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) 等。

將低溫保存的凍干粉從冰箱取出，回置室溫，低速離心后，稱取適量粉未溶于無菌S緩沖液(1.0 M Sorbitol,10 mM PIPES,pH 6.5) 配制成10mg/ml (200U/ml) 儲存液，置于4能穩(wěn)定保存2周(無菌條件下)。

二、制備原生質球 (Spheroplasting protocol)

2.1 室溫條件，5000rpm (3000 xg) ，5min離心酵母培養(yǎng)物;

2.2 吸掉上清，收集離心沉淀(酵母細胞) ，記錄濕重;

2.3 用TE緩沖液 (100 mM Tris，pH 8.0，100 mM EDTA) 重懸酵母細胞，按照1.4m/g濕重細胞加量。并用去離子水定容到終體積 3.5ml/g濕重細胞。

2.4 按照17.5 μl/g濕重細胞加入β -疏基醇，目的是為了除去細胞外層甘需聚糖層;

2.5 30°C孵育并保持低速搖晃，處于對數(shù)期生長的酵母孵育15min，處于穩(wěn)定期生長的酵母孵45min

2.6 室溫條件，5000rpm離心5min:

2.7 用S緩沖液 (1.0 M Sorbitol, 10 mM PIPES,pH 6.5) 重懸細胞，加4.0ml S緩沖液/g濕重細胞

2.8 室溫條件，5000rpm離心5min;

2.9 再次用S緩沖液(4.0ml/g濕重細胞) 重懸細胞，另加入Zymolyases (50U/g濕重細胞，對200U/ml儲存液，則加入250ul);初始用此酶，最好根據(jù)實際情況進行用量的優(yōu)化。

2.10 30°C輕搖溫育混合液30min，根據(jù)以下方式監(jiān)測原生質球形成程度:

a)加1ul樣品到20ul S緩沖液內(nèi)，原生質球應該保持完整:

b) 加1ul樣品到20ul去離子水中，原生質球應該破裂:顯微鏡下觀察比較兩個樣品。

2.11 一般情況下反應45-60min，原生質球的形成量>90%，此時4℃下離心收集細胞，5000rpm，5min:

2.12 再次用S緩沖液(2 ml/g濕重細胞) 重懸原生質球，5000rpm離心5min; 重復此步驟2次

2.13 原生質球沉淀可置于-70℃凍存。

三、酵母基因組DNA的制備 (Preparation of yeast genomic DNA)

以下操作步驟簡單快速，適合于少量酵母培養(yǎng)物內(nèi)基因組DNA的制備.

3.1 將過夜培養(yǎng)的10ml酵母菌培養(yǎng)物離心收集沉淀，加入280ul TE Buffer,30 ul去離子水和3 ul β-疏基乙醇;

3.3 30℃溫育45min;

3.3 以臺式離心機的最高速度離心2-3s，棄上清液，沉淀用500ul  S緩沖液重懸，再次離心棄上清:

3.4 用500ul含有1 mg/ml Zymolyase 20T的S緩沖液重懸沉淀(或者使用自行優(yōu)化后的最佳酶濃度)

3.5 30℃溫育1h;

3.6 重復步驟3.3

3.7 用200ul含有0.1%SDS和2ug蛋白酶K的TE buffer重懸沉淀

3.8 37℃溫育3小時，中間時不時的混勻下溶液

3.9 轉到65℃溫育20min; 從水浴鍋內(nèi)取出并冷卻至室溫

3.10 用200ul 1:1的Tris飽和酚-氯仿混合液萃取，游渦混勻并離心: 從離心機內(nèi)取出并保留上清液

3.11 用200ul氯仿基取上清液，之后重復旋渦混勻及離心:

3.12 加入500ul 95%乙醇到上清液內(nèi)，20℃沉淀10min:

3.13 4℃下，15000 xg離心20 min;

3.14 自然風干或者于真空離心基發(fā)濃縮器內(nèi)晾干除去多余的乙醇，并加入200ul TE緩沖液(合有150 mMNaCI和1 ug RNase A) 溶解DNA;

3.15 37℃溫育1小時:

3.16 重復步聚3.10和3.11:

3.17 加入2.5倍體積的95%乙醇，20℃沉淀10min;

3.18 30ul去離子水重懸DNA。對1:500的DNA稀釋液測量A260，根據(jù)消光系數(shù)計算DNA產(chǎn)量;產(chǎn)量大約為40-50ug。