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染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)

        染色質(zhì)免疫沉淀法(Chromatin ImmunoprecipitationChIP)是一種基于抗原抗體反應(yīng)的特異性,從而起到選擇性地使DNA結(jié)合蛋白及其DNA靶標(biāo)富集的作用,是在全基因組水平研究生命體組織或細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的一種技術(shù)方法。近年來(lái),隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展,ChIP 技術(shù)不斷發(fā)展和完善, 被廣泛應(yīng)用于體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與靶基因啟動(dòng)子上特異核苷酸序列結(jié)合方面的研究, 并成為在染色質(zhì)水平研究基因表達(dá)調(diào)控的有效方法。特別是,此技術(shù)與 DNA 芯片和分子克隆技術(shù)相結(jié)合,可用于高通量篩選已知蛋白因子的未知DNA 靶位點(diǎn)和研究反式作用因子在整個(gè)基因組上的分布情況,這將有助于深入研究DNA 與蛋白質(zhì)相互作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

                                  圖1. 染色質(zhì)免疫沉淀

技術(shù)原理:

       在活細(xì)胞狀態(tài)下,當(dāng)用甲醛處理時(shí),相互靠近的蛋白與蛋白、蛋白與核酸(DNARNA)之間會(huì)產(chǎn)生共價(jià)鍵。細(xì)胞內(nèi),當(dāng)TFPromoter相互結(jié)合時(shí),它們必然靠的比較近或者契合在一起,這個(gè)時(shí)候用甲醛處理,能使它們之間產(chǎn)生共價(jià)鍵。固定的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物通過(guò)超聲或酶處理將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,然后通過(guò)抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)沉淀此復(fù)合體,特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段,通過(guò)對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè),從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。通過(guò)qPCR或二代測(cè)序,篩選與目的蛋白互作的未知DNA信息。

                                                                          圖2. 染色質(zhì)免疫共沉淀原理

實(shí)驗(yàn)流程:

 

1、交聯(lián)和裂解

作用:將細(xì)胞或組織進(jìn)行固定(交聯(lián))與裂解。

新鮮組織或活細(xì)胞中加入甲醛,目的是穩(wěn)定蛋白與DNA天然結(jié)合的狀態(tài),以免后續(xù)的實(shí)驗(yàn)步驟破壞這種相互作用。在固定完成后,細(xì)胞或組織進(jìn)行充分裂解。

2、染色質(zhì)片段化

作用:細(xì)胞核材料片段化是獲得良好的 ChIP 分辨率的關(guān)鍵因素,理想情況下的片段大小在 200 800 bp對(duì)之間。剪切是最難控制的步驟之一。

 將染色質(zhì)打斷成200-500 bp的小片段,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,結(jié)合了目的蛋白的片段將被抗體識(shí)別而保留,沒有結(jié)合目的蛋白的小片段則將被洗脫。在進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)前,一般會(huì)將打斷后的樣品取一部分進(jìn)行解交聯(lián)和DNA純化,通過(guò)瓊脂糖電泳或者毛細(xì)管電泳檢測(cè)其片段化范圍是否符合下游實(shí)驗(yàn)的需求。


注意:此時(shí)可以停 ChIP。經(jīng)過(guò)剪切/消化染色質(zhì)后,可以將樣品于 -80°C 儲(chǔ)存。避免反復(fù)凍融。

3、免疫沉淀與DNA純化

作用:此步驟通過(guò)目的蛋白的特異抗體,對(duì)“DNA-目的蛋白復(fù)合物進(jìn)行富集與洗脫。后續(xù)進(jìn)行解交聯(lián)與蛋白消化,最后純化DNA分子。

 IP實(shí)驗(yàn)除了有實(shí)驗(yàn)組,還應(yīng)該有陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空磁珠組,用以質(zhì)控IP實(shí)驗(yàn)流程是否合格。實(shí)驗(yàn)組加入目的蛋白對(duì)應(yīng)的抗體,抗體應(yīng)該選用IP級(jí)別的抗體,WB抗體不一定能滿足IP實(shí)驗(yàn),具體參見抗體說(shuō)明。陽(yáng)性對(duì)照一般選用已知的組蛋白抗體;陰性對(duì)照采用與目的蛋白抗體相同種屬來(lái)源的血清;空磁珠組則不加任何抗體。


注意:此時(shí)可以停 ChIP。經(jīng)過(guò)解交聯(lián)和/DNA 純化后,可以將樣品于 -20°C 儲(chǔ)存。

4、定量 DNA

作用:qPCR可以對(duì)目的片段進(jìn)行定量分析。通過(guò)對(duì)目的序列的擴(kuò)增,并與Input、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的量對(duì)比,就可以證明目的蛋白是否與預(yù)想的DNA序列發(fā)生了相互作用。

 ChIP-Seq 是將回收純化的DNA進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序,用于發(fā)現(xiàn)目的蛋白潛在結(jié)合的DNA序列。

注意事項(xiàng)

(1) 交聯(lián):甲醛是最常用的交聯(lián)劑,具有形成可逆交聯(lián)的優(yōu)勢(shì)。然而,需控制交聯(lián)時(shí)間,過(guò)長(zhǎng)的交聯(lián)時(shí)間可能導(dǎo)致超聲波破碎困難,甚至引起蛋白質(zhì)與DNA的非直接結(jié)合。此外,經(jīng)甲醛固定后,消化酶可能無(wú)法再進(jìn)行消化。

 (2) 染色質(zhì)切割:使用超聲破碎時(shí),需要優(yōu)化條件以獲得200–500 bp的染色質(zhì)片段。影響超聲破碎的因素包括樣品體積、超聲探頭深度、超聲強(qiáng)度和超聲時(shí)間。建議在4°C條件下進(jìn)行超聲。核酸酶消化須嚴(yán)格監(jiān)控時(shí)間,以防止過(guò)度消化導(dǎo)致的亞核體形成,這會(huì)干擾后續(xù)DNA-蛋白質(zhì)互作檢測(cè)。

 (3) 抗體選擇:選擇合適的抗體對(duì)實(shí)驗(yàn)成功至關(guān)重要。推薦選用免疫沉淀級(jí)別(IP級(jí)別)的抗體,并根據(jù)需求選擇單克隆或多克隆抗體。單抗具有較高的特異性,但識(shí)別位點(diǎn)單一;若目的蛋白的識(shí)別位點(diǎn)被其它分子阻塞,則可能無(wú)法有效識(shí)別。根據(jù)所選抗體類型,配合使用Protein A或G磁珠。

 (4) 操作要點(diǎn):整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)盡量在4°C下進(jìn)行,以保持樣本的穩(wěn)定性。操作時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡,以防影響反應(yīng)效率和結(jié)果準(zhǔn)確性。

 (5) 結(jié)果分析:獲得DNA片段并不直接證明目的蛋白與DNA的直接結(jié)合。如果與目的蛋白形成復(fù)合物的其它蛋白與DNA有結(jié)合作用,也可能使DNA富集。因此,在解釋結(jié)果時(shí)需考慮其他可能性。