自1983年經(jīng)典的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法問世以來，核酸擴(kuò)增技術(shù)已滲透到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。然而，盡管它的基本范圍，PCR一直被限制在實(shí)驗(yàn)室的墻壁內(nèi)，由于它需要一個(gè)復(fù)雜的熱循環(huán)機(jī)器，限制了在低資源環(huán)境下的外部應(yīng)用。新的等溫?cái)U(kuò)增策略正在尋求突破傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室界限，提供恒溫核酸復(fù)制。在這些方法中，重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)是發(fā)展最快的方法之一，盡管它的引入相對(duì)較晚，但它的吸收和市場(chǎng)發(fā)展也很快。至關(guān)重要的是，RPA的技術(shù)增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)室外高度可獲取和敏感的核酸擴(kuò)增，甚至是自我檢測(cè)。在這里，我們?nèi)婊仡櫫?/span>RPA在其發(fā)展的第一個(gè)十年中的無設(shè)備簡(jiǎn)單性。本文綜述了RPA技術(shù)的關(guān)鍵知識(shí)，如其反應(yīng)成分、機(jī)理、靈敏度和特異性以及獨(dú)特的檢測(cè)方法。該綜述還提供了開發(fā)RPA分析的技術(shù)訣竅，以及有關(guān)商用RPA反應(yīng)試劑盒和附件的信息。通過對(duì)已發(fā)表文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)挖掘，我們總結(jié)了關(guān)鍵的RPA實(shí)驗(yàn)提示和問題，以幫助研究人員掌握RPA反應(yīng)。我們還概述了RPA發(fā)展的影響力的熱點(diǎn)，并展望了未來的發(fā)展前景以及對(duì)超越PCR和進(jìn)一步革新生命科學(xué)的影響。

簡(jiǎn)介及概述

      體外核酸擴(kuò)增(NAA)是遺傳物質(zhì)的人工復(fù)制，已滲透到生命科學(xué)和生物技術(shù)的各個(gè)領(lǐng)域，如病原體檢測(cè)、癌癥研究、克隆、測(cè)序、基因工程、合成生物學(xué)、基因分型、誘變、犯罪法醫(yī)鑒定、藥物發(fā)現(xiàn)、分子考古學(xué)、食品檢測(cè)、健康和生活方式檢測(cè)等。這場(chǎng)爆炸性的革命始于1983年Kary Mullis發(fā)明的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。從根本上說，PCR是一個(gè)循環(huán)過程，通過提供有利于核酸復(fù)制過程的連續(xù)溫度(鏈變性、引物退火和酶延伸)，從單個(gè)核酸分子到體外數(shù)十億拷貝進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。分子數(shù)量的增加使得核酸的處理和后續(xù)應(yīng)用變得更加容易，減少了使用有毒放射性探針來跟蹤分子存在的需求，并在應(yīng)用方面產(chǎn)生了巨大的創(chuàng)造力。然而，盡管PCR很有價(jià)值，但需要一個(gè)復(fù)雜的熱循環(huán)器來提供循環(huán)加熱和冷卻過程，這在很大程度上限制了PCR在實(shí)驗(yàn)室墻壁內(nèi)的實(shí)施，阻礙了其在低資源環(huán)境中的應(yīng)用。

      核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的最新進(jìn)展為人工核酸復(fù)制提供了簡(jiǎn)化的孵育條件，只需要恒溫而不需要熱循環(huán)。單溫孵育減少了對(duì)設(shè)備的要求，為突破實(shí)驗(yàn)室的界限開辟了新的途徑，并在資源匱乏的環(huán)境中進(jìn)行擴(kuò)增。通過減少放大時(shí)間，消除重復(fù)加熱和冷卻步驟也為低資源實(shí)施提供了第二個(gè)優(yōu)勢(shì)。更快的反應(yīng)發(fā)生不僅是因?yàn)榧訜岷屠鋮s時(shí)間的減少，而且還因?yàn)槎鄠€(gè)分子反應(yīng)可以異步進(jìn)行，而不是被迫在人工加熱和冷卻循環(huán)中依次進(jìn)行。自20世紀(jì)90年代初以來，大量的等溫核酸擴(kuò)增方法采用了各種反應(yīng)機(jī)制。最完善的方法包括基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA，也稱為轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增，TMA)、核糖核酸(RNA)技術(shù)的信號(hào)介導(dǎo)擴(kuò)增(SMART)、解旋酶依賴性擴(kuò)增(HDA)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、多重位移擴(kuò)增(MDA)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)和鏈位移擴(kuò)增(SDA);讀者可以在一些評(píng)論中參考這些方法的細(xì)節(jié)。2-5特別是重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)技術(shù)，由于其設(shè)備要求簡(jiǎn)化和反應(yīng)時(shí)間快，盡管其引入相對(duì)較晚，但其發(fā)展迅速，市場(chǎng)份額不斷增加(圖1)。

圖1 RPA首次推出以來的市場(chǎng)份額和出版物數(shù)量匯總。(A): RPA在等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)中的市場(chǎng)份額百分比。經(jīng)參考文獻(xiàn)7許可轉(zhuǎn)載。版權(quán)所有2018 Grand View Research, Inc. (B):基于web of science收集的數(shù)據(jù)，2006 - 2017年RPA出版物編號(hào)。

    RPA最早是在2006年由來自ASM科學(xué)有限公司(英國(guó)劍橋，由Wellcome Trust Sanger研究所創(chuàng)立)的Niall Armes引入的雖然在等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)中，RPA尚未占據(jù)較大的市場(chǎng)份額百分比(根據(jù)大觀研究報(bào)告的數(shù)據(jù)，圖7)。1A)，它正經(jīng)歷著最迅速的吸收。到目前為止，已經(jīng)出版了250多份關(guān)于RPA的出版物，在過去六年中，RPA出版物的數(shù)量持續(xù)增加;值得注意的是，RPA出版物數(shù)量從2014年開始呈指數(shù)增長(zhǎng)(圖1B)。其中，2014 - 2018年連續(xù)發(fā)表了5篇RPA綜述論文。Zaghloul和El-shahat的綜述側(cè)重于RPA在丙型肝炎病毒診斷中的應(yīng)用;Moore和Jaykus的綜述強(qiáng)調(diào)了用于檢測(cè)腸道病毒的RPA分析;James和Macdonald,10 Daher等人11和Lobato和O' sullivan的綜述12描述并總結(jié)了RPA在護(hù)理點(diǎn)(POC)診斷中應(yīng)用的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。在此，我們對(duì)RPA的自由基性質(zhì)和發(fā)展?jié)摿M(jìn)行了綜述。首先介紹RPA技術(shù)的關(guān)鍵方面，即反應(yīng)成分和機(jī)制。隨后，我們提供開發(fā)RPA分析的專業(yè)知識(shí)，包括設(shè)計(jì)和選擇寡核苷酸(引物，探針和模板);還提供了有關(guān)市售RPA反應(yīng)試劑盒和附件的信息。對(duì)于那些對(duì)RPA的技術(shù)實(shí)現(xiàn)感興趣的人，我們通過數(shù)據(jù)挖掘已發(fā)表的文獻(xiàn)總結(jié)了關(guān)鍵的RPA實(shí)驗(yàn)技巧和問題，以幫助研究人員更好地掌握RPA反應(yīng)。隨后，通過整理數(shù)據(jù)(如RPA文獻(xiàn)中的敏感性和特異性)闡明RPA的臨床/現(xiàn)場(chǎng)表現(xiàn)。我們還描述了一些獨(dú)特的RPA檢測(cè)方法，為那些誰想要檢測(cè)RPA分析信號(hào)使用的方法，而不是常用的PCR檢測(cè)方法。為了解該技術(shù)在超越PCR和突破實(shí)驗(yàn)室界限方面的重要意義，我們討論了RPA的發(fā)展熱點(diǎn)，包括定量RPA、多重RPA反應(yīng)、移動(dòng)RPA診斷、微流體集成RPA檢測(cè)和一步法RPA檢測(cè)。最后，對(duì)RPA的未來發(fā)展進(jìn)行了展望。

重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)反應(yīng)

      RPA作為取代PCR的革命性方法的突出之處在于其特定的反應(yīng)組分(表1)和機(jī)理。對(duì)于一個(gè)成功的RPA分析，細(xì)微差別取決于內(nèi)在因素，引物，探針和核酸模板的設(shè)計(jì);并且與外部因素有關(guān)，如反應(yīng)溫度和攪拌，對(duì)錯(cuò)配的耐受性，抑制劑和背景DNA。此外，RPA過程中的核酸標(biāo)記、RPA擴(kuò)增子清理和擴(kuò)增后處理也是成功檢測(cè)RPA的重要細(xì)節(jié)。本節(jié)提供了從RPA文獻(xiàn)中總結(jié)的這些實(shí)用信息，作為RPA試驗(yàn)設(shè)計(jì)的指導(dǎo)。此外，讀者還可以獲得有關(guān)市售RPA反應(yīng)試劑盒和附件的信息(表2和3)。最后，本節(jié)通過對(duì)RPA文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)挖掘來闡明RPA的臨床/現(xiàn)場(chǎng)表現(xiàn)，這些文獻(xiàn)也被簡(jiǎn)潔地整理(表4和5)。

2.1 反應(yīng)成分

      RPA的基本反應(yīng)機(jī)制依賴于對(duì)稱為同源重組的自然細(xì)胞過程的綜合工程適應(yīng)，這是DNA代謝的關(guān)鍵過程。標(biāo)準(zhǔn)的RPA反應(yīng)試劑包括三個(gè)關(guān)鍵蛋白(重組酶、重組酶裝載因子和單鏈結(jié)合蛋白)，隨后與輔助成分如脫氧核糖核酸(DNA)聚合酶、擁擠劑、能量/燃料成分(如三磷酸腺苷、ATP)和鹽分子協(xié)調(diào)，執(zhí)行RPA反應(yīng)機(jī)制(圖2)詳細(xì)的反應(yīng)組分及其典型濃度和作用

2.2 機(jī)制

     RPA首先與T4 UvsX蛋白(重組酶)結(jié)合，在T4 UvsY(裝載因子)的輔助下，與引物結(jié)合形成核蛋白絲。由此產(chǎn)生的復(fù)合體在雙鏈DNA中尋找同源序列(圖2)。一旦同源性被定位，復(fù)合體侵入雙鏈DNA，形成d環(huán)結(jié)構(gòu)。D-loop的一側(cè)是雙鏈，引物與模板鏈雜交，引發(fā)鏈交換反應(yīng)，而D-loop的另一側(cè)保持單鏈，即由SSB蛋白(T4 gp32)穩(wěn)定結(jié)合未纏繞的互補(bǔ)鏈。隨后，重組酶從核蛋白絲上分解，并立即可用以啟動(dòng)另一個(gè)新的引物鏈置換反應(yīng)。

引物結(jié)合允許DNA聚合酶(Bsu或Sau)從引物末端的游離3 ' -OH開始合成。隨著聚合的繼續(xù)，兩條親本鏈繼續(xù)分離。正向和反向引物的結(jié)合使鏈合成在兩個(gè)方向上同時(shí)發(fā)生，并最終導(dǎo)致擴(kuò)增的雙鏈DNA呈指數(shù)級(jí)積累，由正向和反向引物之間的序列組成。

     在RPA過程中，重組酶-引物復(fù)合物的形成是d環(huán)形成的速率限制。據(jù)報(bào)道，當(dāng)T4 UvsX蛋白完全包裹引物而不與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)，d環(huán)的形成是最有效的。SSB蛋白和T4 UvsY(連同ATP)已被證明是與T4 UvsX一起合作進(jìn)行鏈交換反應(yīng)所必需的蛋白質(zhì)。然而，這兩種蛋白質(zhì)的存在需要更高濃度的T4 UvsX蛋白，而只需要其中一種蛋白質(zhì)的存在。SSB蛋白可以刺激T4 UvsX降解時(shí)的鏈交換反應(yīng)。重要的是，T4 UvsY蛋白中和了SSB蛋白和T4 UvsX之間對(duì)引物結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)，阻止了SSB結(jié)合引物引發(fā)重組事件。當(dāng)引物濃度較低時(shí)，SSB蛋白抑制T4 UvsX蛋白的鏈交換活性。然而，一旦提供T4 UvsY蛋白，T4 UvsY蛋白就能夠侵入覆蓋SSB蛋白的引物，促進(jìn)T4 UvsX蛋白與引物的結(jié)合(從與結(jié)合的T4 UvsY蛋白相鄰的位點(diǎn))，從而取代引物上的SSB蛋白。

2.3Template,primers, probe and their designs 模板，引物，探針設(shè)計(jì)

       RPA最初被證明是DNA的核酸擴(kuò)增方法6，后來發(fā)現(xiàn)在同一反應(yīng)管中加入逆轉(zhuǎn)錄酶(如小鼠白血病病毒(MuLV)逆轉(zhuǎn)錄酶)也可以作為RNA的模板36，無論何種核酸模板類型，為了有效擴(kuò)增，推薦的RPA擴(kuò)增子長(zhǎng)度應(yīng)低于500個(gè)核苷酸。大多數(shù)已發(fā)表的RPA論文的擴(kuò)增子長(zhǎng)度在100到250個(gè)核苷酸之間，這通常會(huì)產(chǎn)生快速有效的擴(kuò)增。然而，也報(bào)道了較短的擴(kuò)增子(79個(gè)核苷酸;37個(gè)，94個(gè)核苷酸，38 - 40個(gè))和較長(zhǎng)的擴(kuò)增子(1500個(gè)核苷酸6和1941個(gè)核苷酸)。

     與PCR不同，RPA引物的長(zhǎng)度相對(duì)較長(zhǎng)(建議至少為30個(gè)核苷酸，但通常在32至35個(gè)核苷酸之間)。較短的PCR引物(通常在18到25個(gè)核苷酸之間)也可以用于RPA反應(yīng)，但可能會(huì)降低反應(yīng)速度和靈敏度。Mayboroda等人、Martorell等人、Wang等人和Fuller等人已經(jīng)證明了短鏈PCR引物在RPA中的應(yīng)用。后兩位作者表明，與PCR相比，RPA中使用的PCR引物具有更高的檢測(cè)靈敏度:RPA分別檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因GTS 40-3-2大豆的100個(gè)DNA拷貝和農(nóng)桿菌的3.5 pg基因組DNA，而基準(zhǔn)PCR分別檢測(cè)到1000個(gè)DNA拷貝和350 pg基因組DNA。

      銷售商業(yè)化RPA試劑的公司TwistDx?Ltd(詳見第2.4節(jié)和表2和3)提供了可在RPA反應(yīng)期間納入的附加探針。TwistAmp?exo探針(通常在46至52個(gè)核苷酸之間)和TwistAmp?fpg探針(通常在32至35個(gè)核苷酸之間)用于熒光實(shí)時(shí)檢測(cè)(圖3A和B)。這兩個(gè)探針通常用熒光團(tuán)、猝滅劑(例如黑洞猝滅劑)標(biāo)記，該猝滅劑靠近熒光團(tuán)，以暫時(shí)阻止熒光信號(hào)，以及阻斷劑(例如c3間隔劑、磷酸鹽、實(shí)時(shí)檢測(cè)是基于熒光探針在熒光團(tuán)和猝滅劑之間的堿基位點(diǎn)(也稱為無嘌呤/無嘧啶位點(diǎn)，位于DNA中(較少出現(xiàn)在RNA中)，既沒有嘌呤也沒有嘧啶堿基)上的切割。堿基位點(diǎn)可以是四氫呋喃(THF)或dSpacer (THF的衍生物)或dR基團(tuán)(基位通過C-O-C連接體的脫氧核糖)。大腸桿菌外切酶III在THF或dSpacer位點(diǎn)切割TwistAmp?外顯子探針，而糖基化酶/裂解酶大腸桿菌fpg在dR位點(diǎn)切割TwistAmp?fpg探針(圖3A和B)。酶切后，TwistAmp?外顯子探針可以作為正向引物。然而，由于糖基化酶/裂解酶大腸桿菌fpg蛋白的不同催化模式(β -消除)，TwistAmp?fpg探針不能作為引物，該引物不能產(chǎn)生可擴(kuò)展的3 ' -OH基團(tuán)，而是3 ' -磷酸基團(tuán)。

      第三種探針TwistAmp?LF(通常在46到52個(gè)核苷酸之間)用于橫向流動(dòng)條帶檢測(cè)(圖3C)。該探針在5 '端被標(biāo)記(例如用熒光素)，在3 '端有一個(gè)阻滯劑，和一個(gè)內(nèi)部基礎(chǔ)位點(diǎn)(THF或dSpacer)。Nfo內(nèi)切酶IV在TwistAmp?LF探針的這個(gè)基本位點(diǎn)切割，并產(chǎn)生一個(gè)可擴(kuò)展的3 ' -OH基團(tuán)用于聚合。然而，與大腸桿菌內(nèi)切酶III在RPA反應(yīng)中降解大部分?jǐn)U增子不同，Nfo內(nèi)切酶IV產(chǎn)生較慢的信號(hào)和不完全裂解以避免擴(kuò)增子降解(也見2.8節(jié))。因此，TwistAmp?LF探針也可用于選擇凝膠電泳(GE)作為檢測(cè)方法的情況。

為了選擇合適的RPA模板，設(shè)計(jì)引物和探針，用戶可以參考TwistAmp?反應(yīng)試劑盒手冊(cè)中建議的標(biāo)準(zhǔn)，簡(jiǎn)而言之：

(1) 建議在模板上選擇核苷酸序列成分相對(duì)“均衡”的一個(gè)區(qū)域：

? GC 含量在 40% 到 60% 之間

? 重復(fù)序列

? 很少正向/反向重復(fù)、回文等

應(yīng)避開特定基因組內(nèi)的重復(fù)序列，以保持靶標(biāo)的唯一性。就這一點(diǎn)而言， 首選序列的確定方法與 PCR 中的方法大致相同。

(2) 引物GC含量應(yīng)在30% ~ 70%之間，5′端應(yīng)避免鳥嘌呤長(zhǎng)跡，推薦胞苷類;

? 引物大小最小 30，最大 36

? 引物 GC% 最小 20%，最大 70%

? 引物 Tm 最小 50，最大 100

? 最大允許的單核苷酸重復(fù)長(zhǎng)度（例如“CCCCC”）設(shè)定為 5。

(3)引物3′端推薦添加鳥嘌呤和胞苷，以提高性能。從RPA文獻(xiàn)中，進(jìn)一步建議用戶評(píng)估這些寡核苷酸之間的熔融溫度、雜化穩(wěn)定性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和二聚體形成。特定的軟件，如BioEdit version 7.0.5.3, Primer3, unfold,mFOLD, Oligoanalyzer 3.1 (IDT, Leuven, Belgium)， PrimerQuest軟件(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)和Visual OMP (DNA軟件，MI, USA)已在文獻(xiàn)中用于分析RPA寡核苷酸特性。一種有效的避免引物二聚體形成的方法是采用自回避分子識(shí)別系統(tǒng)(SAMRS)，通過在引物中包含SAMRS核苷酸2-氨基嘌呤-2 '脫氧核糖糖苷(A*)、2 ' -脫氧-2-硫胸苷(T*)、2 ' -脫氧肌苷(G*)和n4 -乙基-2 ' -脫氧胞苷(C*)這些SAMRS核苷酸的包含策略性地將天然A對(duì)與T(和G對(duì)與C)之間的氫鍵單元替換為天然T對(duì)與SAMRS A*、天然A對(duì)與SAMRS T*、天然A對(duì)與SAMRS T*、天然C對(duì)與SAMRS C*之間的氫鍵單元。然而，無論SAMRS A*和SAMRS G*核苷酸的濃度如何，它們都不會(huì)分別與SAMRS T*和SAMRS C*核苷酸相互作用。在核酸擴(kuò)增過程中可以避免因引物二聚體而產(chǎn)生的不良產(chǎn)物。52,53這樣的SAMRS系統(tǒng)已經(jīng)被Sharma和他的同事在RPA反應(yīng)中證明了，并且被證明可以成功地消除RPA假陽(yáng)性。此外，需要謹(jǐn)慎避免引物和探針之間的重疊，這已顯示出阻礙所需的擴(kuò)增效率?？偟膩碚f，遵循所描述的指南作為RPA候選寡核苷酸的計(jì)算機(jī)優(yōu)化設(shè)計(jì)的起點(diǎn)就足夠了，然而，最終的候選物應(yīng)該通過RPA反應(yīng)進(jìn)行篩選，以選擇適用于特定RPA測(cè)定的首選最終寡核苷酸集(例如，TwistDx?Ltd建議設(shè)計(jì)5個(gè)正向和反向引物，以及3個(gè)探針)。

2.4 TwistDx?商業(yè)化試劑盒及儀器

2.5 Influence of temperature and agitation溫度和攪拌的影響

      為了使RPA反應(yīng)達(dá)到最佳的效率和分析靈敏度，靶序列的選擇以及相應(yīng)引物和探針的設(shè)計(jì)是RPA反應(yīng)的內(nèi)在決定因素，而反應(yīng)溫度和反應(yīng)過程中的攪拌是兩個(gè)最重要的外在影響因素。

      推薦的RPA反應(yīng)溫度在37°C - 42°C之間，Crannell等和Wang等人也證明了RPA反應(yīng)可以通過體溫進(jìn)行，這有利于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。然而，一些研究小組已經(jīng)研究了RPA反應(yīng)溫度超出推薦范圍的情況。測(cè)試的最大溫度范圍為15℃~ 50℃;結(jié)果表明，產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果的邊際反應(yīng)溫度應(yīng)大于30℃。然而，Sun等人和Poulton和Webster研究表明，在低至25℃的溫度下，經(jīng)過RPA擴(kuò)增和隨后的側(cè)流條帶檢測(cè)，仍然可以產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)。此外，Lillis等研究表明，環(huán)境溫度對(duì)RPA反應(yīng)也有影響:當(dāng)環(huán)境溫度低于10℃時(shí)，RPA反應(yīng)是不穩(wěn)定的，但延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間可以提高陽(yáng)性結(jié)果的可得性。這種反應(yīng)溫度范圍的研究表明，RPA反應(yīng)不需要精確的溫度控制。

      雖然反應(yīng)溫度為RPA酶提供了合適的工作環(huán)境，但攪拌增加了均相反應(yīng)溶液中RPA組分之間的相互作用。TwistDx?建議用戶執(zhí)行RPA反應(yīng)的兩次混合步驟，一次在反應(yīng)開始時(shí)，另一次在反應(yīng)4分鐘后。前者是將所有的RPA試劑混合在一起引發(fā)反應(yīng)，后者是防止反應(yīng)試劑的局部耗竭，從而提高反應(yīng)收率。Wambua等人報(bào)道，當(dāng)攪拌4分鐘后形成時(shí)，在5-8分鐘內(nèi)達(dá)到閾值熒光值，而在沒有攪拌的情況下達(dá)到可檢測(cè)水平的時(shí)間為8 - 14分鐘。此外，不斷震動(dòng)的RPA反應(yīng)貫穿始終進(jìn)一步加快了RPA反應(yīng)速度，獲得了更穩(wěn)定的陽(yáng)性結(jié)果，提高了靈敏度，特別是當(dāng)模板濃度接近檢測(cè)極限時(shí)。Kersting等人報(bào)道，與推薦的兩次震動(dòng)相比，持續(xù)震動(dòng)會(huì)在橫向流帶上產(chǎn)生更快、更穩(wěn)定的信號(hào)。Kalsi等人也報(bào)道了RPA exo分析法中微滴的連續(xù)混合可以縮短出結(jié)果的時(shí)間，增加熒光并提高靈敏度。此外，Moody等人建立了數(shù)學(xué)模型，結(jié)果表明，機(jī)械攪拌優(yōu)于手動(dòng)攪拌，可以消除操作員之間的變化，獲得一致的定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果;然而，理想的混合頻率是化驗(yàn)依賴，并應(yīng)確定在反應(yīng)之前。然而，如果沒有搖晃條件，Lillis等人證明，減少反應(yīng)體積(例如從50μL到5μL)可以補(bǔ)償搖晃效應(yīng)，因?yàn)檩^小的體積增加了擴(kuò)增所需的試劑和寡核苷酸之間的相互作用。

2.6  Tolerability to mismatches, inhibitors and background DNA DNA錯(cuò)配，抑制劑，背景DNA耐受能力

      除了溫度和攪拌外，對(duì)錯(cuò)配，抑制劑和背景DNA的耐受性是有效和靈敏RPA反應(yīng)的其他重要因素。RPA具有耐受錯(cuò)配的能力，迄今為止報(bào)道的最高的錯(cuò)配受體能力是在引物和探針結(jié)合位點(diǎn)上的9個(gè)核苷酸堿基對(duì)。研究還表明，引物5′端或中心的錯(cuò)配對(duì)RPA反應(yīng)的影響較小，而位于引物3′端的錯(cuò)配對(duì)RPA反應(yīng)的影響較大。這與RPA反應(yīng)機(jī)制一致(見2.2節(jié))，因?yàn)榫酆厦笍?/span>3 '端延伸引物和探針(一旦被切割)。這種錯(cuò)配敏感性在3 '端有用的應(yīng)用是區(qū)分單核苷酸多態(tài)性多態(tài)性(SNP)。Yamanaka等人利用這一特性來區(qū)分煙草使用障礙基因的多態(tài)性;當(dāng)引物的3′端堿基與目標(biāo)匹配時(shí)，DNA聚合酶延伸是有效的，當(dāng)3 '端堿基不匹配時(shí),而DNA聚合酶延伸是低效的或不存在的。

      然而，一般的RPA錯(cuò)配耐受性(在引物的3 '端之外)可能是有利的，因?yàn)樗谝镌O(shè)計(jì)高度多態(tài)性靶標(biāo)時(shí)具有一定的靈活性，在這些靶標(biāo)中，長(zhǎng)期保守的靶標(biāo)區(qū)域很難定位。相反，這種錯(cuò)配耐受性的退縮是對(duì)密切相關(guān)物種的非特異性檢測(cè)的趨勢(shì)。事實(shí)上，Patel等人87、Moore等人88和Yang等人69在檢測(cè)基孔肯雅病毒、流行性人諾如病毒和豬圓環(huán)病毒2型時(shí)，分別觀察到非特異性檢測(cè)。

      在測(cè)試臨床或現(xiàn)場(chǎng)樣品時(shí)，在樣品制備和處理步驟中存在或可能引入許多物質(zhì)(例如抑制劑)，這些物質(zhì)可能會(huì)干擾核酸擴(kuò)增。RPA已被證明耐受某些(PCR)抑制劑，包括:(1)血紅蛋白(20 g L?1)、肝素(0.5 U)和尿液(1.25%)對(duì)RPA反應(yīng)沒有影響；62、91 (2)血紅蛋白(50 g L?1)、乙醇(4% v/v)和尿液(高達(dá)5%)，它們僅輕微影響反應(yīng)。62,91,92 然而，在SDS (0.05% v/v)和尿液(10%)的存在下，RPA反應(yīng)被完全抑制。62,91 還觀察到，當(dāng)DNA模板濃度接近檢測(cè)極限時(shí)，RPA反應(yīng)更容易受到抑制劑的影響。然而，仔細(xì)考慮樣品制備和處理步驟的萃取緩沖液或培養(yǎng)介質(zhì)的選擇也很重要，因?yàn)檫@些工作溶液也可能含有潛在的抑制劑。例如，Valasevich和Schneider72發(fā)現(xiàn)十六烷基三甲基溴化銨(CTAB) DNA提取緩沖液強(qiáng)烈抑制RPA反應(yīng)。同樣，Liu et al.93發(fā)現(xiàn)亞硒酸鹽胱氨酸肉湯(細(xì)菌富集培養(yǎng)基)顯著影響RPA反應(yīng)，導(dǎo)致大量引物二聚體，導(dǎo)致側(cè)流條帶檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性。

      除了耐受抑制劑外，RPA還能夠在背景DNA存在的情況下擴(kuò)增靶核酸。94 - 97然而，與對(duì)抑制劑的耐受性類似，對(duì)背景DNA的耐受性也依賴于濃度。Clancy等人97觀察到，當(dāng)存在400 ng背景人DNA時(shí)，RPA反應(yīng)被顯著抑制，但當(dāng)存在200 ng背景人DNA時(shí)，RPA反應(yīng)的抑制程度要小得多。Rohrman和RichardsKortum94表明，當(dāng)存在50份人類免疫缺陷病毒1 (HIV-1)靶DNA時(shí)，0.5μg剪切鮭魚精子DNA可以完全抑制RPA，而當(dāng)存在103份或106份靶DNA時(shí)，剪切鮭魚精子DNA僅能抑制2或5μg RPA。此外，Rohrman和Richards-Kortum94還指出，試驗(yàn)中使用的引物、探針和靶序列會(huì)影響最大背景DNA濃度耐受性。當(dāng)103份HIV-1和惡性瘧原蟲的靶DNA存在時(shí)，2μg剪切鮭魚精子DNA分別完全抑制了HIV-1和惡性瘧原蟲的RPA檢測(cè)，然而當(dāng)存在相同數(shù)量的目標(biāo)DNA(103份)時(shí)，溶組織內(nèi)阿米巴和十二指腸賈第鞭毛蟲分別僅被1μg和0.5μg剪切的鮭魚精子DNA完全抑制94。

2.7 Nucleic acid labelling during RPA RPA過程中的核酸標(biāo)記

      多種下游RPA應(yīng)用(例如側(cè)流條帶檢測(cè)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)的一個(gè)重要過程是在RPA反應(yīng)期間將標(biāo)簽納入核酸模板中，以便納入的標(biāo)簽允許捕獲，檢測(cè)和/或協(xié)助RPA分析的信號(hào)生成。這種核酸標(biāo)記可以末端使用5 '標(biāo)記的引物或內(nèi)部通過標(biāo)記的核苷酸來實(shí)現(xiàn)。39,40,98 - 104用于核酸標(biāo)記的標(biāo)簽可以是熒光實(shí)體(例如熒光素)、配體(例如生物素)或甚至是核苷酸的短片段(懸垂)。大多數(shù)使用RPA的末端核酸標(biāo)記都使用5 '標(biāo)記的正向和反向引物，這樣擴(kuò)增子具有雙重標(biāo)記，可以在下游檢測(cè)中被相應(yīng)的識(shí)別分子捕獲和檢測(cè)。然而，RPA僅通過5 '標(biāo)記過程耐受某些標(biāo)簽。Crannell et al.105報(bào)道了5種不同的5 ' -標(biāo)記(Cy5、Cy3、溴脫氧尿嘧啶、四氯熒光素和六氯熒光素)與3種5 ' -標(biāo)記(Alexa Fluor488、熒光素和地高辛)成功結(jié)合的RPA失敗案例。

      對(duì)于RPA過程中的內(nèi)部核酸標(biāo)記，反應(yīng)混合物可以補(bǔ)充標(biāo)記的核苷酸，主要是使用地高辛- dutps，在聚合酶延伸過程中隨機(jī)替代dTTPs來產(chǎn)生標(biāo)記的擴(kuò)增子。101-104與末端標(biāo)記相比，內(nèi)部標(biāo)記允許將更多的標(biāo)記并入單個(gè)核酸模板，從而在下游分析中具有更多的結(jié)合機(jī)會(huì)。然而，當(dāng)下游應(yīng)用于三明治分析時(shí)，末端標(biāo)記可能是一個(gè)更好的選擇，因?yàn)橥ㄟ^末端標(biāo)記結(jié)合的兩個(gè)標(biāo)簽相距更遠(yuǎn)(由擴(kuò)增子的長(zhǎng)度分開)，如果標(biāo)簽靠得太近，這可以防止結(jié)合的空間位阻。

2.8,Amplicon,clean-up,and,post-amplification treatment擴(kuò)增子的純化和擴(kuò)增后處理

      上述問題考慮了RPA反應(yīng)前和反應(yīng)時(shí)的條件。此外，反應(yīng)后處理流程對(duì)于成功檢測(cè)RPA信號(hào)至關(guān)重要，應(yīng)根據(jù)RPA擴(kuò)增子的預(yù)期用途來確定。RPA擴(kuò)增子的產(chǎn)生依賴于RPA反應(yīng)試劑盒。使用TwistAmp?Basic試劑盒(也稱為Basic RT試劑盒)從正向和反向引物中產(chǎn)生單個(gè)擴(kuò)增子。相反，使用TwistAmp?exo試劑盒(也包括exo RT試劑盒)和TwistAmp?fpg試劑盒不會(huì)產(chǎn)生單個(gè)擴(kuò)增子，前者是由于反應(yīng)混合物中存在的外切酶在RPA反應(yīng)中消化了大部分?jǐn)U增子42，后者是由于糖基化酶/裂解酶大腸桿菌fpg裂解產(chǎn)生不可擴(kuò)展的3 ' -磷酸基(參見第2.3節(jié))46，然而，對(duì)于TwistAmp?nfo試劑盒，由于DNA聚合酶對(duì)探針引物模板的置換活性，產(chǎn)生了兩種類型的擴(kuò)增子:雙標(biāo)記擴(kuò)增子作為探針和其中一種引物的短產(chǎn)物出現(xiàn)，而單標(biāo)記擴(kuò)增子作為正引物和反向引物的長(zhǎng)產(chǎn)物出現(xiàn)(圖3C)(注意，在基于夾心法的橫向流條檢測(cè)的測(cè)試區(qū)域中，只有雙標(biāo)記產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào))105 - 108。

      然而，RPA擴(kuò)增子最初與蛋白質(zhì)和擁擠劑相關(guān)，由此產(chǎn)生的DNA -蛋白質(zhì)-擁擠劑復(fù)合物阻止了直接使用DNA分子進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。109,110這是因?yàn)檫@些復(fù)合物影響了凝膠電泳中擴(kuò)增子的正確遷移，導(dǎo)致凝膠上的團(tuán)塊涂片。在凝膠電泳檢測(cè)之前，文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了幾種方法來處理RPA擴(kuò)增子，這些方法包括通過加熱(65°C或95°C 10分鐘)和洗滌劑處理(例如十二烷基硫酸鈉，SDS)使蛋白質(zhì)變性，酶切(例如proteinase K)，通過高速離心使蛋白質(zhì)沉淀，并使用商業(yè)DNA清理試劑盒進(jìn)行純化。其中加熱法與蛋白酶K消化法或SDS處理法的效果相當(dāng)。109,111然而，在65℃下加熱10分鐘比在更高溫度下(95℃)加熱效果更好。SDS處理(在上樣緩沖液中占20%)產(chǎn)生的凝膠帶比蛋白酶K消化法(0.2 mg mL - 1或20 mg mL - 1)產(chǎn)生的凝膠帶更亮、更厚109;而在Londono和同事的研究結(jié)果中，65°C 加熱10分鐘產(chǎn)生的凝膠帶的亮度與SDS處理方法(在上樣緩沖液中占5%或10%)產(chǎn)生的凝膠帶相當(dāng)。Kapoor及其同事表明，SDS處理方法(在加載緩沖液中占5%)比加熱方法(65°C 10分鐘)產(chǎn)生更亮的凝膠帶，但也導(dǎo)致靶帶上方出現(xiàn)涂片樣圖案。111,112與加熱、蛋白酶K消化和SDS處理方法相比，使用商業(yè)化DNA清理試劑盒只產(chǎn)生目標(biāo)條帶，但條帶強(qiáng)度低得多。此外，作為一種替代方法，離心(3分鐘)對(duì)顆粒RPA蛋白的性能與加熱方法(65°C,10分鐘)相當(dāng)。

      與橫向流動(dòng)條帶檢測(cè)一樣，可以直接使用RPA擴(kuò)增子，但建議在運(yùn)行條帶之前用運(yùn)行緩沖液(例如1/100稀釋)稀釋擴(kuò)增子，以(1)提高其吸濕性能114和(2)避免“鬼帶”效應(yīng)。45,54,115 - 117值得注意的是，Powell及其同事指出，通過替換高分子量PEG (5.5% 35 kDa;114 .另見2.1節(jié))，在RPA試劑配方中使用低分子量PEG (6.5% 3 kDa)。此外，Powell及其同事還開發(fā)了一種方法，以減輕橫向流動(dòng)條帶檢測(cè)的稀釋步驟。他們發(fā)現(xiàn)，有時(shí)RPA擴(kuò)增子在“RPA微球”中不可用（核酸擴(kuò)增的核心包含局部的RPA試劑圖5A）。其形成與PEG高度相關(guān)，用于結(jié)合到側(cè)流條測(cè)試線上。然而，使用雙標(biāo)記探針(兩個(gè)標(biāo)簽通過短長(zhǎng)度連接物連接)可以在酶切后從“RPA球”中逃逸，允許擴(kuò)增子準(zhǔn)備好進(jìn)行下游三明治檢測(cè)(圖5B)114。

2.9 Sensitivities and specificities靈敏性和特異性

      RPA的靈敏性和特異性可分為兩類，即分析性和臨床(或現(xiàn)場(chǎng))。分析靈敏度表示測(cè)定法可以檢測(cè)到的最低分析物量(也稱為檢測(cè)限);分析特異性是一種分析方法測(cè)量樣品中一種特定分析物而不是其他分析物的能力。118 臨床敏感性是臨床陽(yáng)性樣本的正確檢出百分比，而臨床特異性是臨床陰性樣本的正確檢出百分比。

      從分析靈敏度和特異性的角度來看，RPA非常敏感，可以檢測(cè)到少量被分析物的分子(拷貝)，接近PCR的分析靈敏度(表5)。此外，RPA也可以實(shí)現(xiàn)超靈敏的檢測(cè)，甚至可以檢測(cè)到單個(gè)被分析物的拷貝(表4)。在大多數(shù)情況下，RPA對(duì)于將一個(gè)物種與其他非密切相關(guān)的物種區(qū)分開來是非常特異性的。這些酶進(jìn)行同源性定向修復(fù)的天然功能成為RPA區(qū)分近緣物種的缺點(diǎn)，特別是當(dāng)這些物種具有高序列相似性時(shí)。69,87,88相反，這表明RPA可以在一定程度上容忍引物或探針與目標(biāo)序列的不匹配(詳見2.6節(jié))。

      除了測(cè)量分析靈敏度和分析特異性外，許多研究者還將RPA應(yīng)用于臨床或現(xiàn)場(chǎng)樣品的檢測(cè)，并將結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法(多為PCR)進(jìn)行比較。從總結(jié)表5可以看出，RPA的臨床敏感性僅為基準(zhǔn)法的一半，而RPA的臨床特異性大部分時(shí)間與基準(zhǔn)法相當(dāng)。這些結(jié)果表明，RPA可能(僅在某些情況下)誤檢陽(yáng)性樣本(假陰性)，但不太可能顯示假陽(yáng)性?？傊?，RPA仍處于臨床/現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)評(píng)價(jià)的初期，尚未成熟到可以作為臨床/現(xiàn)場(chǎng)常規(guī)試驗(yàn)。