產(chǎn)品信息

      牛痘病毒加帽體系利用牛痘病毒加帽酶及相關(guān)組分，將 7-甲基鳥苷帽結(jié)構(gòu)（m7Gppp，Cap0）加到 RNA 的 5′ 末端。在真核生物中，該結(jié)構(gòu)與 mRNA 的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯密切相關(guān)。使用酶促反應(yīng)為 RNA 加帽是一種簡(jiǎn)單有效的方法，且帽結(jié)構(gòu)與天然Cap 0 結(jié)構(gòu)完全一致，能顯著改善用于體外轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)染和顯微注射的 RNA 的穩(wěn)定性和翻譯能力。這種酶由兩個(gè)亞基（D1 和D12）組成 （圖 1a），D1 亞基執(zhí)行 RNA 三磷酸酶和鳥苷轉(zhuǎn)移酶的功能，D12 亞基執(zhí)行鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶的功能，它們對(duì)于添加一個(gè)完整的 Cap 0 結(jié)構(gòu) m7Gppp5′N 都是必須的（圖 1b）。 

a.  b.  

圖1. 牛痘病毒加帽的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理。a. 牛痘病毒加帽酶和 GTP（紅色）、SAH（玫紅）的共結(jié)晶結(jié)構(gòu) (PDB 4CKB) 。該酶由 D1 和 D12 兩個(gè)亞基組成，兼具RNA 三磷酸酶（藍(lán)色）、鳥苷轉(zhuǎn)移酶（橙色）和鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（米黃色）的功能。本圖引自 Ramanathan, A., Robb, G. B., & Chan, S. H. (2016). mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Res 44(16), 7511–7526. b. mRNA 的帽結(jié)構(gòu)是由一個(gè) 7-甲基鳥苷通過一個(gè)5′–5′三磷酸酯橋連接到mRNA 鏈的5′核苷上組成。Cap-0 結(jié)構(gòu)由相鄰的 RNA 鏈通過三種酶的依次反應(yīng)形成。進(jìn)一步形成 cap-1 結(jié)構(gòu)需要2’-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的參與，該修飾可以降低 RNA 在體內(nèi)引起的細(xì)胞先天免疫反應(yīng)。本圖引自 Decroly, E., Ferron, F., Lescar, J. et al. (2012). Conventional and unconventional mechanisms for capping viral mRNA. Nat Rev Microbiol 10, 51–65。 
     本體系可用于 IVT RNA 的加帽反應(yīng)，使加帽反應(yīng)在 1h 之內(nèi)完成，效率接近 100%，并且保證正確的方向。IVT 推薦使用近岸蛋白質(zhì) T7 High Yield RNA Transcription kit（貨號(hào)：E131）。 
產(chǎn)品用途：
      體內(nèi)或體外翻譯前 mRNA的加帽和 mRNA的 5’末端標(biāo)記。     
注意事項(xiàng)：   
     SAM：需事先計(jì)算好 SAM 的用量，在反應(yīng)開始前把分裝的 32 mM 的儲(chǔ)備液稀釋成 2 mM 的工作液。SAM 在 pH 7-8，37°C條件下不穩(wěn)定，需要在反應(yīng)開始之前新鮮配置。為避免 SAM 降解，該工作液需要保存于冰上。 
     RNA：在加帽體系使用之前，應(yīng)將體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生的 RNA 進(jìn)行純化并溶解于 RNase-free 水中，不能將 RNA 溶解在 EDTA溶液或其他鹽溶液中。 
     RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)：一些 RNA 轉(zhuǎn)錄本可能形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)（同源二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)），如二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄本的 5'端會(huì)影響加帽效率。在與加帽酶反應(yīng)之前加熱 RNA 可以去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 5′端的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如果轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的 5′端結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可以把加熱時(shí)間延長(zhǎng)至 10min，加帽反應(yīng)時(shí)間可延長(zhǎng)至 60min。 
     Cap 0-和 Cap 1-mRNA：Cap 0-和 Cap 1-mRNA 之間的差異在 RNA 5'端緊鄰帽結(jié)構(gòu)的第一位核苷酸（N1）是否具有 2'-O-甲基。在高等真核細(xì)胞中，該甲基化是天然加帽過程的一部分，Cap 1 結(jié)構(gòu)提高了 mRNA 的翻譯效率。 


      近岸蛋白質(zhì) Vaccinia Capping System 可以與 mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase（貨號(hào)：M072）在一個(gè)體系內(nèi)同時(shí)工作產(chǎn)生Cap 1 結(jié)構(gòu)。當(dāng)使用新的細(xì)胞系或翻譯系統(tǒng)時(shí)，建議比較 Cap 0-和 Cap 1-mRNA 翻譯效率和免疫原性，以確定最佳的帽子結(jié)構(gòu)。 
Poly(A) 尾：如果加帽的 RNA 需要添加 3'-poly(A)尾巴，可以使用近岸蛋白質(zhì) E. coli Poly(A) Polymerase（貨號(hào)：M012）進(jìn)行加尾。加帽和加尾后的 RNA 需在進(jìn)行 RNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前做純化處理。 
      RNase Inhibitor：在配置反應(yīng)體系時(shí)，可以加入 0.5 μl 近岸蛋白質(zhì) RNase 抑制劑（貨號(hào)：E125），同時(shí)去掉等體積的 RNase-free 水。 
      RNA5’端標(biāo)記：在用于 RNA 5′端標(biāo)記時(shí)，GTP 儲(chǔ)備液應(yīng)稀釋到 mRNA 濃度的 1-3 倍。 
For research and manufacturing use only.