產(chǎn)品信息

      MagCapture? 外泌體提取試劑盒 PS 采用磷酯酰絲氨酸（PS）親和 Tim４蛋白固化磁珠（PS親和法）的方法可以簡便快捷地提取高純度的完整外泌體和其他細(xì)胞外囊泡（EVs）。如果想要得到更高純度的外泌體，請使用 10,000×g 離心后的上清。該試劑盒使用含有 EDTA 的中性洗脫緩沖液將外泌體完整洗脫下來，所提取的完整外泌體和其他 EVs 可用于不同實(shí)驗(yàn)，包括電鏡分析（TEM）、納米粒子追蹤（NTA）分析、投喂實(shí)驗(yàn)、分子組成（蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等）分析等。

◆膜表面磷酯酰絲氨酸（PS）親和法

Tim４蛋白固化磁珠，在金屬離子存在的條件下親和細(xì)胞外囊泡表面的磷酯酰絲氨酸（PS），然后使用含有 EDTA 的洗脫液進(jìn)行洗脫，捕獲高純度的完整細(xì)胞外囊泡。

◆優(yōu)點(diǎn)?特色

 
使用新型親和提取方法

 無需進(jìn)行超濾
●　使用磁珠改進(jìn)了操作
●　流程優(yōu)化
※　高重復(fù)性   

樣品類型：細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿、尿液等。

●　可以純化高純度和完整的細(xì)胞外囊泡

●　可以從細(xì)胞上清液、血清、血漿和尿液中純化外囊泡

●　重復(fù)性高，回收量穩(wěn)定

●　簡易操作（約3.5小時(shí)）

●　啟用多個(gè)樣品（無需超速離心）

◆試劑盒組成

●　檢測抗體

      抗 CD9 兔多抗，System Bioscience公司

      抗 CD63 兔多抗，System Bioscience公司

●　免疫印跡（WB）數(shù)據(jù)

      各樣品結(jié)果相當(dāng)于 150 μL 的血清樣本。從 100 μL 提取物中取出 15 μL，添加５μL的 4×SDS 樣品緩沖液，全部上樣。

從人EDTA血漿中提取外泌體

分別從１mL 的 EDTA 血漿、EDTA 血漿（超濾更換緩沖液）、人血清中提取外泌體，進(jìn)行 WB 檢測（抗 Flotillin2 抗體）。

●　檢測抗體

      抗 Flotillin-2小鼠單抗（29/Fotillin-2），BD Bioscience 公司

●　使用樣品量

      各１mL

●　免疫印跡（WB）數(shù)據(jù)

      各樣品結(jié)果分別對應(yīng) 150 μL 樣品量。從 100 μL 提取物中取出 15 μL，添加５μL的 4×SDS 樣品緩沖液，全部上樣。

從人尿液中提取外泌體的回收量比較

１mL人尿液分別通過本試劑盒、聚合物沉淀法、超離法進(jìn)行外泌體回收，并做免疫印跡（WB）檢測（抗 CD9 抗體）。

●　檢測抗體

   抗 CD9 兔多抗，System Biosciences 公司

●　使用樣品量

   各１mL

●　免疫印跡（WB）數(shù)據(jù)

   各樣品結(jié)果分別對應(yīng) 150 μL 尿液樣品。從 100 μL 提取物中取出 15 μL，加入５μL的 4×SDS 樣品緩沖液，全部上樣。

◆與傳統(tǒng)沉淀法的功能比較實(shí)驗(yàn)

分別用本試劑盒、超離心法和聚合物沉淀法從K562（人慢性骨髓性白血?。┘?xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)上清或 10% Exosome-depleted FBS 添加培養(yǎng)基）提取外泌體，分別比較三種方法的外泌體回收量和外泌體純度。

MagCapture? 外泌體提取試劑盒 PS【PS 親和法】

按照試劑盒的操作說明（反應(yīng)時(shí)間：3小時(shí)），從1 mL經(jīng)過離心處理（10,000×g，30min）的 K562 細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或 10% Exosome-depleted FBS 添加培養(yǎng)基※1）中提取外泌體。

超速離心法

將 10 mL 經(jīng)過離心處理（10,000×g，30 min）的 K562 細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或 10% Exosome-depleted FBS 添加培養(yǎng)基※1）進(jìn)行超離（110,000×g，70 min），用 TBS 緩沖液重懸沉淀物后，再進(jìn)行超離（110,000×g，70 min），回收沉淀部分。

聚合物沉淀法

從 1 mL 經(jīng)過離心處理（10,000×g，30 min）的 K562 細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或 10% Exosome-depleted FBS 添加培養(yǎng)基※1）中，按照市售的A公司產(chǎn)品的操作說明（靜置時(shí)間：過夜）提取外泌體。

※1：110,000×g 離心２小時(shí)，在不吸到沉淀的前提下回收上清。

比較提取的外泌體的透射電子顯微鏡（TEM）分析結(jié)果和納米粒子追蹤（NTA）分析結(jié)果

分別用本試劑盒、超離法、聚合物沉淀法提取外泌體，用 NanoSight LM10 檢測外泌體片段的粒子直徑。另外，用最終濃度為２%的多聚甲醛固定提取到的外泌體片段（２~4×10¹⁰ particles），在透射電子顯微鏡進(jìn)行分析。

電子顯微鏡圖像 數(shù)據(jù)提供：金澤大學(xué) 醫(yī)學(xué)系 華山教授、大阪大學(xué) iFReC 中井先生

MagCapture? 可提取到很多 100 nm 左右的粒子，在透射電子顯微鏡中也可以確認(rèn)到很多細(xì)胞外囊泡。

K562 細(xì)胞培養(yǎng)上清提取的外泌體回收量和純度的比較（無血清培養(yǎng)基）

用 PS 親和法、超離法和聚合物沉淀法從 K562 細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基）獲得樣品進(jìn)行電泳。接著用銀染色和 WB 法（CD63, Flotilin-2 和 Lamp-1 抗體）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

回收量，不是回收率

●　檢測抗體

     抗 CD63 小鼠單抗（MEM-259）

     抗 Flotillin-2 小鼠單抗  （29/Flotillin-2），BD Bioscience 公司

     抗 Lamp-1 小鼠單抗 （25/Lamp-1），BD Bioscience 公司

K562 細(xì)胞培養(yǎng)上清提取外泌體的回收量和純度的比較（10% FBS-添加培養(yǎng)基）

用 MagCapture? 外泌體提取試劑盒 、超離法和聚合物沉淀法，從 K562 細(xì)胞培養(yǎng)上清（10% 去外泌體 FBS 補(bǔ)充培養(yǎng)基）獲得樣品進(jìn)行電泳，用銀染法和 WB 法（CD63、Lamp-1 和 Flotilin-2 抗體）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，對外泌體提取片段進(jìn)行質(zhì)譜測定，比較所有測定的多肽中來自 K562 細(xì)胞的人來源多肽的比例（由于添加到細(xì)胞培養(yǎng)基的FBS中牛蛋白聚集體是混雜的，所以人來源多肽的比率會(huì)下降）。

●　檢測抗體

     抗 CD63 小鼠單抗（MEM-259）

     抗 Flotillin-2 小鼠單抗 （29/Flotillin-2），BD Bioscience 公司

     抗 Lamp-1 小鼠單抗（25/Lamp-1），BD Bioscience 公司

     健康人血清來源的外泌體中提取 miRNA 和 mRNA 的回收量比較

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

①運(yùn)用不同方法提取外泌體并比較從中提取的 microRNA 和 mRNA 的回收量

通過超離法和 PS 親和法將 EVs 從正常人血清中分離，然后使用 microRNA 提取試劑盒（產(chǎn)品編號295-71701）提取 RNA。通過 qRT-PCR 分析提取的 RNA，并比較 microRNA（let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p）、mRNA（GAPDH, PIK3CB）的 Ct 值。

相比超離法，PS親和法提取所得EVs中的microRNA和mRNA得到更高產(chǎn)量。

②運(yùn)用不同的 RNA 提取方法提取 microRNA 和 mRNA 的回收量比較

運(yùn)用 PS 親和法將 EVs 從正常人血清中分離，然后使用 microRNA 提取試劑盒（產(chǎn)品編號295-71701）或基于 AGPC 法的試劑提取 RNA。通過 qRT-PCR 分析提取的 RNA，并比較 microRNA（let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p）、mRNA（GAPDH, PIK3CB）的 Ct 值。

◆外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析

<實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果>

分別利用 PS 親和法、超離法、聚合物沉淀法，從含 10% FBS（不含外泌體）的 K562 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中提取外泌體。將提取樣品用 10% 聚丙烯酰胺電泳分離，剪切出全部的蛋白質(zhì)條帶。然后在凝膠內(nèi)進(jìn)行消化，用 LC-MS 對蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。對上述三種方法提取的外泌體進(jìn)行蛋白質(zhì)組合的相關(guān)性比較。

比較通過 MASS 分析鑒定的前 10 個(gè)蛋白質(zhì)

白色柱：源自外囊泡的人類蛋白質(zhì)

灰色柱：來自 FBS 的牛蛋白污染物

紅 色：來自外囊泡的標(biāo)記蛋白

樣品：K562 細(xì)胞培養(yǎng)基（含有10%去除外泌體胎牛血清）

成對組合相關(guān)性比較

◆應(yīng)用數(shù)據(jù)

Protein Assay BCA Kit 檢測外泌體的蛋白質(zhì)濃度

Protein Assay BCA Kit 是利用二辛可寧酸（BCA）定量檢測溶液中的蛋白質(zhì)濃度的試劑盒，是蛋白質(zhì)定量檢測法中最通用的方法。其原理為，堿性條件下的蛋白質(zhì) Cu²⁺ 離子被還原為 Cu⁺。Cu⁺與 BCA 形成絡(luò)合物，即產(chǎn)生紫色螯合物，蛋白質(zhì)濃度與紫色螯合物顏色深淺有關(guān)，通過測定 562 nm 處的吸光度，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線做比照，即可定量溶液中的蛋白質(zhì)濃度。

利用 MagCapture? 外泌體提取試劑盒從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中提取外泌體，通過 Protein Assay BCA Kit 高靈敏的檢測外泌體中蛋白質(zhì)濃度。

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果】

將通過 MagCapture? 外泌體提取試劑盒提取的 25 μL 外泌體溶液分注于96孔板中，加入 Protein Assay BCA Kit 中試劑Ａ和試劑Ｂ混合液 200 μL。之后 60℃ 孵育 30 分鐘，檢測 560 nm 吸光度（圖1）。結(jié)果表明，通過 Protein Assay BCA Kit 的高靈敏度檢測，可測定提取后外泌體中蛋白質(zhì)濃度。

圖1. Protein Assay BCA Kit 檢測BSA的檢量線和提取的外泌體蛋白質(zhì)濃度的檢測

<BCA Assay 操作概要>

由于外泌體蛋白質(zhì)濃度相當(dāng)?shù)?，因?span> BCA 測定時(shí)不要稀釋樣品。

①　將 BSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液按照 250、125、62.5、31.25、15.625 μg／mL 和空白對照，分別每孔 25 μL 加到 96 孔板中。

②    分別把提取的外泌體和洗脫緩沖液（空白）按照每孔 25 μL 加入 96 孔板。

③    把 200μL Protein Assay BCA Kit（產(chǎn)品編號：297-73101）的試劑Ａ盒試劑Ｂ混合液（Ａ：Ｂ=50：1）加入放有樣品的孔板中。

④    60℃ 孵育 30 分鐘

⑤    室溫條件下降低孔板溫度

⑥    測定 560 nm 的吸光度

◆外泌體的標(biāo)記和Hela細(xì)胞導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)

【實(shí)驗(yàn)概要】

用 PKH67（Sigma公司）標(biāo)記 MagCapture? 外泌體提取試劑盒提取的細(xì)胞外囊泡， Hela 細(xì)胞導(dǎo)入確認(rèn)。

<外泌體PKH67標(biāo)記>

1. MagCapture? 外泌體提取試劑盒提取外泌體（實(shí)驗(yàn)當(dāng)天從 K562 細(xì)胞培養(yǎng)上清液提取外泌體）。

2. 用 BCA Assay 和 NanoSight 檢測樣品的蛋白質(zhì)濃度和粒子濃度。

3. 將相當(dāng)于5 μg*蛋白量的外泌體樣品溶液分裝至1.5 mL管中。

   *請配制合適的使用量。

4. 將 2.0 μL 的 PKH linker 溶解在 0.25 mL 的 DiluentC 中。…4×Dye solution*

   *請配制合適的使用量。

5. 添加1/3樣品量的 4×Dye solution 至樣品中，混合后在室溫中孵育 5-10 分鐘。

6. 根據(jù)附帶的操作說明用 PBS 平衡 Exosome Spin Columns （MW 3000）（Thermo 公司）。

7. 將 100 μL 樣品分別加入上述平衡后的旋轉(zhuǎn)柱*中，離心（最大添加量：100 μL）。

   *準(zhǔn)備必需的支數(shù)。

8. 將外泌體溶液*加入到已經(jīng)接種好 Hela 細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，24 小時(shí)后用顯微鏡觀察并利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

   *根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)節(jié)外泌體添加量

圖1. PKH標(biāo)記外泌體的細(xì)胞捕獲觀察

從 16 mL K562 培養(yǎng)上清液中超濾濃縮得到４mL 培養(yǎng)上清液作為樣品，通過 PS 親和法提取外泌體。

●　提取的外泌體蛋白質(zhì)濃度：22.3 ng/μL

●　粒子濃度：1.2×10⁸ particles/mL

將上述標(biāo)記的外泌體溶液全部加入接種好的 Hela 細(xì)胞中，24小時(shí)后用熒光顯微鏡（左）和流式細(xì)胞儀（右）檢測捕獲情況。

Opti-MEM：取相同量用 PKH 標(biāo)記后添加到細(xì)胞中作為陰性對照。

◆細(xì)胞培養(yǎng)上清?血清?血漿的預(yù)處理操作

樣品預(yù)處理：對樣品進(jìn)行 1,200×g 離心操作※1。如果要得到更高純度的外泌體，則按照下述步驟對樣品進(jìn)行 10,000×g 離心操作※2。

下文是細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清/血漿的預(yù)處理方法。其他體液樣品的預(yù)處理操作，請參考血清/血漿的實(shí)驗(yàn)步驟，做適當(dāng)調(diào)整。

更換緩沖液（限制過濾）操作

用 50 mL TBS 緩沖液對１mL 已經(jīng)經(jīng)過離心處理的 EDTA 血漿樣品進(jìn)行緩沖液更換。

1. 把 19 mL TBS 加進(jìn) VivaSpin20（100K）中。

2. 把 １mL 離心過的 EDTA 血漿上清添加在第１. 的VivaSpin20（100K）中，混勻。

3. 把第２. 的VivaSpin20（100K）在４℃下進(jìn)行離心處理。

4. 減少上線的液體后，在 VivaSpin20（100K）中追加 10 mL TBS 緩沖液。

5. ４℃下離心處理。

6. 減少上面的液體后，在 VivaSpin20（100K）中追加 10 mL TBS 緩沖液。

7. ４℃下離心處理。

8. 減少上面的液體后，在 VivaSpin20（100K）中追加 11 mL TBS 緩沖液。

9. ４℃下離心處理直至樣品液量達(dá)到１mL 以下。

10. 進(jìn)行提取。

◆MagCapture? 外泌體提取試劑盒 操作步驟

◆產(chǎn)品列表

◆相關(guān)產(chǎn)品