產(chǎn)品簡(jiǎn)介

      ChIP-IT High-Sensitivity^?（HS）試劑盒是市場(chǎng)上最靈敏的ChIP試劑盒。它的設(shè)計(jì)能夠進(jìn)行高質(zhì)量的DNA富集。對(duì)于高豐富的目標(biāo)蛋白每個(gè)ChIP反應(yīng)可以使用低至1000個(gè)細(xì)胞。試劑盒也經(jīng)過(guò)優(yōu)化針對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的抗體執(zhí)行染色質(zhì)免疫沉淀時(shí)提供優(yōu)異的結(jié)果，如轉(zhuǎn)錄因子或具有次優(yōu)結(jié)合親和力的抗體。要了解這些功能與我們提供的其他ChIP試劑盒的差異，請(qǐng)參閱我們的ChIP試劑盒選擇指南。

更高的信號(hào)峰和較低的非特異性DNA背景是通過(guò)特制的蛋白G瓊脂糖珠和優(yōu)化的固定，結(jié)合和洗滌緩沖液方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。此外，清洗步驟是通過(guò)重力過(guò)濾實(shí)現(xiàn)的。它比磁珠捕獲更快、更容易、更一致。ChIP-IT High-Sensitivity^?（HS）試劑盒也經(jīng)過(guò)驗(yàn)證可用于ChIP-Seq，包括使用針對(duì)低豐度轉(zhuǎn)錄因子的抗體。

ChIP-IT High Sensitivity^?優(yōu)勢(shì)

低豐度轉(zhuǎn)錄因子或低結(jié)合親和力抗體的理想選擇

• 對(duì)于高豐度目標(biāo)蛋白，每次免疫沉淀反應(yīng)僅從1000個(gè)細(xì)胞中靈敏富集DNA；對(duì)于低豐度轉(zhuǎn)錄因子，可從50000個(gè)細(xì)胞中靈敏富集DNA
• 優(yōu)化的試劑組合降低了非特異性結(jié)合事件引起的背景水平
• 基于重力過(guò)濾的洗滌方案，相比磁珠捕獲，更快、更簡(jiǎn)單、更具一致性
• 在qPCR和ChIP-Seq分析中，高效的實(shí)驗(yàn)流程已在多種樣本類型中得到驗(yàn)證

ChIP-IT High Sensitivity染色質(zhì)免疫沉淀示意圖

在ChIP-IT High-Sensitivity^?的實(shí)驗(yàn)流程中，完整的細(xì)胞用一種特殊配方的甲醛緩沖液固定。這種緩沖液可以交聯(lián)并保持蛋白質(zhì)/DNA的相互作用。然后用超聲將DNA打斷成小片段，并與感興趣的DNA結(jié)合蛋白抗體一起孵育?？贵w結(jié)合的蛋白質(zhì)/DNA復(fù)合物通過(guò)使用蛋白G瓊脂糖珠進(jìn)行免疫沉淀，并通過(guò)重力過(guò)濾洗滌。免疫沉淀后，DNA解交聯(lián)，蛋白質(zhì)被蛋白酶K去除，DNA被回收和純化。ChIP富集的DNA可用于基因特異性分析或全基因組分析。

ChIP-IT High Sensitivity^?數(shù)據(jù)

檢測(cè)低豐度蛋白靶點(diǎn)

ChIP-IT High-Sensitivity^?試劑盒非常適合與其他ChIP方法檢測(cè)不到信號(hào)的具有挑戰(zhàn)性的抗體一起使用,因?yàn)樵摲椒ǖ撵`敏度足以檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)的特定結(jié)合。以下是ChIP-IT High-Sensitivity?試劑盒與其他商用ChIP試劑盒的比較。使用未經(jīng)處理的MCF-7染色質(zhì)和結(jié)合豐度低的轉(zhuǎn)錄輔因子NCOA2抗體進(jìn)行ChIP檢測(cè)。同時(shí)用陰性對(duì)照IgG抗體和陰性對(duì)照引物組（Active Motif，目錄號(hào)71001）檢測(cè)非特異性結(jié)合。只有ChIP-IT High-Sensitivity方法能夠檢測(cè)到NCOA2在特定基因組位置的結(jié)合（ESRRA啟動(dòng)子），信號(hào)比陰性對(duì)照高20倍。盡管ESRRA使用競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手D的試劑盒檢測(cè)到qPCR信號(hào)，但由于陰性對(duì)照引物組的高背景和IgG檢測(cè)到的非特異性結(jié)合，表明其富集水平不夠理想。

針對(duì)低豐度轉(zhuǎn)錄因子的ChIP試劑盒比較
MCF-7染色質(zhì)是根據(jù)每家試劑盒生產(chǎn)廠家的建議從1.5 x 106個(gè)細(xì)胞中制備的。使用針對(duì)低豐度NCOA2蛋白的抗體和陰性對(duì)照IgG進(jìn)行ChIP ，按照試劑盒制造商建議的最佳染色質(zhì)數(shù)量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。富集后，使用ChIP-IT qPCR分析試劑盒（目錄號(hào)53029）進(jìn)行qPCR，以使數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化并可以直接比較結(jié)果。數(shù)據(jù)表示為每1000個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到的結(jié)合事件。數(shù)值為根據(jù)反應(yīng)中染色質(zhì)數(shù)量、最終重懸體積和引物效率調(diào)整后的3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的平均值。

獲得更好的靈敏度

當(dāng)使用高質(zhì)量H3K4me3抗體（目錄號(hào)39915）時(shí)，將ChIP-IT High Sensitivity與其他商用ChIP試劑盒進(jìn)行比較，結(jié)果展示的是分別使用ChIP-IT HS、競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手M、競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手I和競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手D的試劑盒進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照GAPDH啟動(dòng)子（目錄號(hào)71006）檢測(cè)的特定信號(hào)。由于優(yōu)化的條件使ChIP-IT High Sensitivity具有高靈敏度，可檢測(cè)的富集度比競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手M和競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手I獲得的富集度高2-3倍。只有競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手D沒(méi)有表現(xiàn)出良好的富集度，因?yàn)閺年幮詫?duì)照qPCR引物組的信號(hào)和IgG反應(yīng)中的高信號(hào)來(lái)看，非特異性結(jié)合很高。

ChIP-IT High Sensitivity顯示出比競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手ChIP試劑盒更好的富集
MCF-7染色質(zhì)是根據(jù)每家試劑盒生產(chǎn)廠家的建議從1.5 x 106個(gè)細(xì)胞中制備的。使用H3K4me3（目錄號(hào)39915）抗體和陰性對(duì)照IgG進(jìn)行 ChIP，按照試劑盒制造商建議的最佳染色質(zhì)數(shù)量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。富集后，使用ChIP-IT qPCR分析試劑盒（目錄號(hào)53029）進(jìn)行qPCR，以使數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化并可以直接比較結(jié)果。數(shù)據(jù)表示為每1000個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到的結(jié)合事件。數(shù)值為根據(jù)反應(yīng)中染色質(zhì)數(shù)量、最終重懸體積和引物效率調(diào)整后的3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的平均值。

使用更少的樣本量

ChIP-IT High Sensitivity試劑盒中包含的經(jīng)過(guò)優(yōu)化的ChIP緩沖液減少了非特異性DNA的結(jié)合，從而使背景水平最小化。這樣可以提高靈敏度和富集效率。低背景使得使用ChIP-IT High Sensitivity試劑盒在樣本數(shù)量較少條件下的應(yīng)用成為可能。對(duì)于高豐度蛋白質(zhì)，每個(gè)免疫沉淀反應(yīng)只需1000個(gè)細(xì)胞；對(duì)于低豐度蛋白質(zhì)，每個(gè)免疫沉淀反應(yīng)只需50000個(gè)細(xì)胞。在下面的實(shí)驗(yàn)中，使用組蛋白H3K4me3抗體和從1000至100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞制備的不同數(shù)量染色質(zhì)進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)。當(dāng)僅使用1000個(gè)細(xì)胞時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照GAPDH啟動(dòng)子仍能檢測(cè)到顯著的富集。

ChIP-IT High Sensitivity適用于有限的樣本材料
MCF-7染色質(zhì)是根據(jù)ChIP-IT High Sensitivity試劑盒的說(shuō)明書(shū)從10萬(wàn)到400萬(wàn)個(gè)細(xì)胞數(shù)量范圍制備。然后使用Active Motif組蛋白H3K4me3抗體（目錄號(hào)39915）和陰性對(duì)照IgG對(duì)指定數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行免疫沉淀。富集后，使用ChIP-IT qPCR分析試劑盒（目錄號(hào)53029）進(jìn)行qPCR。結(jié)果顯示使用ChIP-IT High Sensitivity試劑盒，陽(yáng)性對(duì)照GAPDH啟動(dòng)子可從1000個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行強(qiáng)富集，而陰性對(duì)照UNR12引物組則沒(méi)有富集。數(shù)據(jù)表示為每1000個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到的結(jié)合事件。數(shù)值為根據(jù)反應(yīng)中染色質(zhì)數(shù)量、最終重懸體積和引物效率調(diào)整后的3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的平均值。

富集的DNA經(jīng)過(guò)ChIP-Seq驗(yàn)證

使用ChIP-IT High Sensitivity試劑盒獲得的高質(zhì)量ChIP DNA，可用于ChIP-Seq等下游應(yīng)用。Active Motif已經(jīng)驗(yàn)證了ChIP-IT High Sensitivity試劑盒可以用于針對(duì)具有挑戰(zhàn)性的低豐度蛋白質(zhì)和高豐度組蛋白抗體的ChIP-Seq，如下所示。

低豐度轉(zhuǎn)錄因子NCOA2的ChIP-Seq數(shù)據(jù)
使用ChIP-IT High Sensitivity試劑盒對(duì)從300萬(wàn)MCF-7細(xì)胞制備染色質(zhì)和低豐度轉(zhuǎn)錄輔因子NCOA2蛋白抗體進(jìn)行ChIP。ChIP DNA經(jīng)過(guò)建庫(kù)，并使用Illumina?下一代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序后，生成3000萬(wàn)條序列。對(duì)序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以確定人類基因組中所有的NCOA2結(jié)合位點(diǎn)。左圖顯示了11號(hào)染色體上100萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)區(qū)域的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。右圖放大顯示兩個(gè)基因啟動(dòng)子的NCOA2信號(hào)峰。

組蛋白H3K4me3的ChIP-Seq數(shù)據(jù)
使用ChIP-IT High Sensitivity試劑盒對(duì)從100萬(wàn)MCF-7細(xì)胞制備的染色質(zhì)和組蛋白H3K4me3（目錄號(hào)39915）抗體進(jìn)行ChIP。ChIP DNA經(jīng)過(guò)建庫(kù)，并使用Illumina?下一代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序后，生成2400萬(wàn)條序列。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以確定人類基因組中所有的H3K4me3結(jié)合位點(diǎn)。左圖顯示在11號(hào)染色體175000bp區(qū)域的5個(gè)基因的啟動(dòng)子中H3K4me3的存在。右圖放大顯示單個(gè)基因的啟動(dòng)子結(jié)合。PPFIA1基因上的結(jié)合信號(hào)在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)出現(xiàn)了共同的雙峰