產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡介

SpCas9 來源于 S. pyogenes 菌株，是依賴于 crRNA 和 tracrRNA(或連接后形成的 sgRNA)引導(dǎo)的 DNA內(nèi)切核酸酶，在靶標雙鏈 DNA 存在 PAM(NGG)的情況下，特異地切割靶標雙鏈 DNA，使 DNA 雙鏈斷裂并生成平末端。PAM 對于 SpCas9 的識別和切割都是必需的，其切割位點位于目標序列(target sequence)內(nèi)，離 PAM 區(qū) 3 個堿基。SpCas9 酶的 HNH 和 RuvC 結(jié)構(gòu)域分別負責(zé)切割靶標雙鏈 DNA 中與 sgRNA 配對和非配對的鏈。本產(chǎn)品中，SpCas9 的 H840 和 D10 都被突變?yōu)?A，從而使其 HNH 和 RuvC 功能域失活，獲得了 Sp-dCas9 酶。因此，Sp-dCas9 只有結(jié)合靶標 DNA 的活性，而沒有切割靶標 DNA 的活性。

產(chǎn)品組分

a. Sp-dCas9 Nuclease 濃度為 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 規(guī)格的總體積為 10 μL，1,000 pmol 規(guī)格的總體積為 100 μL； 

保存條件

-20℃儲存；≤ 0℃運輸。

實驗流程

1. Sp-dCas9 與靶標 DNA 結(jié)合實驗

37℃反應(yīng) 30 min，可通過非變性核酸電泳對實驗結(jié)果進行檢測。

實驗結(jié)果

為了驗證 Sp-dCas9 與 target DNA 的結(jié)合，我們通過 5′端帶 FAM 基團的引物在全長 59 bp 的 targetdsDNA 末端加上 FAM 標記。在 20 μL 反應(yīng)體系中加入 2 μL的 10 × TOLO Buffer 3, 1.5 μL 的 10 μM Sp-dCas9Nuclease, 1.5 μL 的 10 μM sgRNA, 和 3 μL 的 1 μM target dsDNA-FAM, 然后將結(jié)合反應(yīng)體系在 37℃靜置孵育 30 min，用 2%的瓊脂糖凝膠低溫電泳 100 V，60 min 后，在化學(xué)發(fā)光成像分析儀(GE ImageQuantLAS4000)上用熒光通道檢測樣本條帶。實驗結(jié)果表明，Sp-dCas9 + sgRNA + target dsDNA-FAM 泳道電泳跑膠遷移速率較慢，說明 Sp-dCas9 在 sgRNA 的引導(dǎo)下特異地識別并結(jié)合了 target dsDNA。此外，還可以用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)對 Sp-dCas9 與 target DNA 的結(jié)合進行檢測。

注意事項

1. 為防止 RNase 污染，請保持實驗區(qū)干凈整潔，操作時需穿戴干凈的手套、口罩，實驗所用槍頭、離心管等耗材均為 RNase-free。

2. 因反應(yīng)需添加 RNA(sgRNA 或者 crRNA:tracrRNA)，整個體系，包括 Sp-dCas9 酶都必須不含任何其它核酸酶活性。本產(chǎn)品經(jīng)過嚴格質(zhì)控，無任何其它核酸酶污染。

3. 反應(yīng)結(jié)束后，可以采用非變性聚丙烯酰胺（或瓊脂糖）凝膠電泳的方式來檢測 Sp-dCas9 是否結(jié)合靶標雙鏈 DNA。電泳緩沖液體系可使用 DEPC 處理以消除 RNase 的影響；同時，應(yīng)保持低溫下電泳，相關(guān)要求可參考 RNA EMSA 體系。

4. Sp-dCas9 酶對熱敏感，容易失活，應(yīng)全程冰上配置反應(yīng)體系，使用后立即置于-20℃保存。

5. 本產(chǎn)品僅供科研使用。若進行商業(yè)用途，需聯(lián)系專利持有方獲取相關(guān)的專利授權(quán)。