產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

SpCas9 來源于 S. pyogenes 菌株，是依賴于 crRNA 和 tracrRNA(或連接后形成的 sgRNA)引導(dǎo)的 DNA內(nèi)切核酸酶，在靶標(biāo)雙鏈 DNA 存在 PAM(NGG)的情況下，特異地剪切靶標(biāo)雙鏈 DNA，使 DNA 雙鏈斷裂并生成平末端。PAM 對(duì)于 Cas9 的識(shí)別和剪切都是必需的，其剪切位點(diǎn)位于目標(biāo)序列(target sequence)內(nèi)，離 PAM 區(qū) 3 個(gè)堿基。此外，在 PAMmer 序列存在時(shí)，SpCas9 也能特異地剪切單鏈 DNA 或 RNA(詳細(xì)信息請(qǐng)參考 PMID: 24476820；PMID: 25274302)。此酶還可應(yīng)用于體外靶標(biāo) DNA 的剪切、目的片段的克隆等實(shí)驗(yàn)(詳細(xì)信息可參考 PMID: 26323354) 。

產(chǎn)品組分

a. SpCas9 Nuclease 濃度為 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 規(guī)格的總體積為 10 μL，1,000 pmol 規(guī)格的總體積為 100 μL；

b. Control Target DNA and sgRNA 應(yīng)保存于-80℃并避免反復(fù)凍融，必須在 6 個(gè)月內(nèi)使用，使用時(shí)建議取 0.5 μL 至每 20 μL 反應(yīng)體系。 n

保存條件

Control Target DNA and sgRNA 于-80℃儲(chǔ)存，其余組分-20℃儲(chǔ)存；≤ 0℃運(yùn)輸。 n

實(shí)驗(yàn)流程

1. 順式剪切實(shí)驗(yàn)

*若用核酸電泳來分析順式剪切產(chǎn)物，對(duì)于 20 μL 順式剪切應(yīng)體系，推薦 target DNA的使用量為 100 ng～500 ng，且 target DNA片段長(zhǎng)度在 300 bp～3 kb 范圍內(nèi)。不同長(zhǎng)度 target DNA 需要的 Cas 酶和 sgRNA 的量需要根據(jù) target DNA 的摩爾量計(jì)算，建議保持 Cas 酶:sgRNA:target DNA的摩爾比為 10:10:1，以盡量確保 target DNA被剪切完全。

37℃反應(yīng) 30 min~1 h，85℃滅活 5 min。核酸電泳分析順式剪切產(chǎn)物。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注意事項(xiàng)

1. 為防止 RNase 污染，請(qǐng)保持實(shí)驗(yàn)區(qū)干凈整潔，操作時(shí)需穿戴干凈的手套、口罩，實(shí)驗(yàn)所用槍頭、離心管等耗材均為 RNase-free。

2. 因反應(yīng)需添加 RNA(sgRNA 或者 crRNA:tracrRNA)，整個(gè)體系，包括 Cas9 酶都必需不含任何 RNase 活性。本產(chǎn)品經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)控，無任何其它核酸酶污染。

3. Cas9 酶對(duì)熱敏感，容易失活，應(yīng)全程冰上配置反應(yīng)體系，使用后立即置于-20℃保存。

4. Cas9 酶與 DNA、sgRNA 形成復(fù)合物會(huì)影響電泳，需 85℃高溫失活 Cas9 酶后電泳檢測(cè)。

5. 本產(chǎn)品僅供科研使用。