產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

FnCas12a(又名 Cpf1)是由 crRNA 介導(dǎo)的 DNA 核酸內(nèi)切酶，來(lái)源于 Francisella tularensis 菌株FnCas12a在靶標(biāo)雙鏈 DNA 存在 PAM(TTN)序列的情況下，特異地剪切靶標(biāo)雙鏈 DNA，使 DNA 雙鏈斷裂并生成粘性末端。而 FnCas12a 特異地剪切單鏈 DNA 靶標(biāo)不依賴 PAM 序列。此外，雙鏈或單鏈 DNA 靶標(biāo)均能激活FnCas12a 的反式剪切活性(即旁路剪切活性/附屬剪切活性)，即當(dāng) FnCas12a 酶與 crRNA、靶標(biāo) DNA 結(jié)合形成三元復(fù)合物后，便會(huì)被激活針對(duì)非特異序列 ssDNA 的反式剪切活性，將體系中的任意序列 ssDNA 切碎。因此，F(xiàn)nCas12a 酶不僅可用于體外 dsDNA 的特異剪切，也可用于靶標(biāo)核酸的快速檢測(cè)，詳見(jiàn)本公司開(kāi)發(fā)的 HOLMES[1]核酸快檢技術(shù)。

產(chǎn)品組分

a. FnCas12a Nuclease 濃度為 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 規(guī)格的總體積為 10 μL，1,000 pmol 規(guī)格的總體積為 100 μL；

b. Control Target DNA and crRNA 應(yīng)保存于-80℃并避免反復(fù)凍融，必須在 6 個(gè)月內(nèi)使用，使用時(shí)建議取 0.5 μL 至每 20 μL 反應(yīng)體系。

保存條件

Control Target DNA and crRNA 于-80℃儲(chǔ)存，其余組分-20℃儲(chǔ)存；≤ 0℃運(yùn)輸。

活性定義

在總體積為 20 μL 的 1 × HOLMES Buffer 1 [pH 8.5]反應(yīng)體系中，37℃反應(yīng)條件下，1 min 內(nèi)剪切 1 pmolssDNA 探針?biāo)璧?Cas12a 酶量定義為 1 transU[2]。

例：若某批次 FnCas12a 酶的反式剪切活性為 80.0 transU/pmol，則表明 1 pmol 的該批次 FnCas12a 酶可在 1 min 內(nèi)，在上述指定的反應(yīng)條件下，反式剪切 80 pmol ssDNA 探針。本公司提供的 Cas 酶 transU 數(shù)值詳見(jiàn)各批號(hào)的 COA 檢測(cè)報(bào)告。

實(shí)驗(yàn)流程

1. 順式剪切實(shí)驗(yàn)

c. 順式剪切體系中 Target DNA 可為 ssDNA 或帶 PAM 序列的 dsDNA。

*若用核酸電泳來(lái)分析順式剪切產(chǎn)物，建議使用 dsDNA靶標(biāo)，因?yàn)?ssDNA靶標(biāo)會(huì)被反式激活的 Cas12a 進(jìn)一步切碎。對(duì)于 20 μL 順式剪切應(yīng)體系，推薦 target DNA的使用量為 100 ng～500 ng，且 target DNA片段長(zhǎng)度在 300 bp～3 kb 范圍內(nèi)。不同長(zhǎng)度 target DNA需要的 Cas 酶和 crRNA的量需要根據(jù) target DNA的摩爾量計(jì)算，建議保持 Cas 酶:crRNA:target DNA的摩爾比為 10:10:1，以盡量確保 targetDNA被剪切完全。

37℃反應(yīng) 30 min~1 h，85℃滅活 5 min，核酸電泳分析順式剪切產(chǎn)物。

1. 反式剪切實(shí)驗(yàn)

d. 反式剪切體系中 Target DNA 可為 ssDNA 或帶 PAM 序列的 dsDNA。

*反式剪切體系中各組分的用量可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行調(diào)整，用量較少時(shí)可先將各組分稀釋后加入體系，FnCas12a Nuclease 可用 1×HOLMES Buf er 1 稀釋，稀釋后需立即使用（若要稀釋后的 Cas12 酶長(zhǎng)期保存，請(qǐng)使用 Cas12 Dilution Buf er，#32012），crRNA、Target DNA 及 ssDNA Reporter 可用 Nuclease-free Water 稀釋，但極低濃度的 Target DNA（例如 LOD 實(shí)驗(yàn)）建議用 0.1% Tween 20 稀釋并使用低吸附的離心管、吸頭等耗材。

*反式剪切體系中探針的用量和預(yù)期反應(yīng)到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間可參考各批號(hào)Cas 酶transU的具體數(shù)值，詳見(jiàn)本公司提供的 COA檢測(cè)報(bào)告！

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀檢測(cè)熒光信號(hào)，37℃反應(yīng)，每 30 sec 采集一次熒光信號(hào)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注意事項(xiàng)

1. 不同來(lái)源的 Cas12a 酶，其識(shí)別靶標(biāo)所需的 PAM 位點(diǎn)也略有不同，其中大部分 Cas12a 酶可識(shí)別 TTN位點(diǎn)，而部分 Cas12a 則識(shí)別 TTTN 位點(diǎn)。

2. Cas12a 的順式剪切(cis-cleavage)：Cas12a 在 crRNA 的引導(dǎo)下，特異性地剪切 target DNA。dsDNA 靶標(biāo)需帶有 PAM 位點(diǎn)，而 ssDNA 靶標(biāo)不依賴 PAM 位點(diǎn)。

3. Cas12a 的反式剪切(trans-cleavage)：當(dāng) target DNA 存在時(shí)，Cas12a/crRNA 與 target DNA 形成三元復(fù)合物(Cas12a/crRNA/target DNA)，同時(shí)，Cas12a 被激發(fā)反式剪切活性，將反應(yīng)體系中任意序列的單鏈 DNA切碎。

4. 利用本產(chǎn)品的反式剪切活性進(jìn)行分子診斷實(shí)驗(yàn)，可參考本公司的 HOLMES 體系[1]。

5. 驗(yàn)為防止 RNase 污染，請(qǐng)保持實(shí)驗(yàn)區(qū)干凈整潔，操作時(shí)需穿戴干凈的手套、口罩，實(shí)驗(yàn)所用槍頭、離心管等耗材均為 RNase-free。

6. Cas12a 酶對(duì)熱敏感，容易失活，應(yīng)全程冰上配置反應(yīng)體系，并在使用后立即將酶置于-20℃保存。

7. 如無(wú)特殊說(shuō)明，本說(shuō)明書(shū)的剪切反應(yīng)體系適用于本公司提供的所有類型的 Cas12a 酶。

8. 本產(chǎn)品僅供科研使用。

參考文獻(xiàn)

[1] Li S, Cheng Q, Wang J, et al. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection[J]. Cell Discovery. 2018, 4: 20. [2] Lv H, Wang J, Zhang J, et al. Definition of CRISPR Cas12a Trans-Cleavage Units to Facilitate CRISPR Diagnostics[J]. Frontiers in Microbiology. 2021, 12: 766464.