產品信息

產品簡介

LwaCas13a 核酸酶(又名 C2c2)是依賴于 crRNA 介導的 RNA 內切核酸酶，來源于 Leptotrichia wadei 菌株。在靶標單鏈 RNA 存在 PFS 序列的情況下，可特異地識別并剪切靶標 RNA。此外，Cas13a 也具有反式剪切活性(即旁路剪切活性/附屬剪切活性)，即當 LwaCas13a 蛋白與 crRNA、靶標 RNA 結合形成三元復合物后，便會被激活針對非特異序列單鏈 RNA 的反式剪切活性，將體系中的任意序列單鏈 RNA 切碎。該活性也被用于靶標核酸的快速檢測試劑盒的開發(fā)。例如，Broad 研究所的張鋒團隊便利用 Cas13a 蛋白開發(fā)了名為“SHERLOCK”的下一代分子診斷系統(詳細信息請參考 PMID: 28408723)

產品組分

a. LwaCas13a Nuclease 濃度為 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 規(guī)格的總體積為 10 μL，1,000 pmol 規(guī)格的總體積為 100 μL；

b. Control Target RNAand crRNA應保存于-80℃并避免反復凍融，必須在 6 個月內使用，使用時建議取 0.5 μL 至每 20 μL 反應體系；

c. ssRNAReporter(FAM-BHQ1)應避光保存于-80℃并避免反復凍融，必須在 6 個月內使用，使用時建議取 0.5 μL 至每 20 μL 反應體系。

保存條件

   Control Target RNA and crRNA 以及 ssRNA Reporter(FAM-BHQ1)于-80℃儲存，其余組分-20℃儲存；≤ 0℃運輸。

活性定義

    在總體積為 20 μL 的 1 × HOLMES Buffer 2 [pH 7.6]反應體系中，37℃反應條件下，1 min 內剪切1 pmol ssRNA 探針所需的 Cas13a 酶量定義為 1 transU。

例：若某批次 LwaCas13a 酶的反式切割活性為 9.0 transU/pmol，則表明 1 pmol 的該批次 LwaCas13a酶可在 1 min 內，在上述指定的反應條件下，反式切割 9 pmol ssRNA 探針。本公司提供的 Cas 酶 transU數值詳見各批號的 COA 檢測報告。

實驗流程

1. 反式剪切實驗

*反式剪切體系中各組分的用量可以根據不同的實驗目的進行調整，用量較少時可先將各組分稀釋后加入體系，LwaCas13a Nuclease 可用 1×HOLMES Buf er 2 稀釋，稀釋后需立即使用（若要稀釋后的 Cas13 酶長期保存，請使用 Cas13 Dilution Buf er，#32013），crRNA、

Target RNA 及 ssRNA Reporter 可用 Nuclease-free Water 稀釋，但極低濃度的 Target RNA（例如 LOD 實驗）建議用 0.1% Tween 20 稀釋并使用低吸附的離心管、吸頭等耗材。

*反式剪切體系中探針的用量和預期反應到達平臺期的時間可參考各批號 Cas 酶 transU 的具體數值，詳見本公司提供的 COA檢測報告。

    實時熒光定量 PCR 儀檢測熒光信號，37℃反應，每 30 sec 采集一次熒光信號。

實驗結果

注意事項

    1. Cas13a 的順式剪切(cis-cleavage): Cas13a 在 crRNA 的引導下，特異性地剪切 target RNA，且對 target RNA的 PFS 序列要求并不嚴格。

2. Cas13a 的反式剪切(trans-cleavage): 當 target RNA 存在時，Cas13a/crRNA 與 target RNA 形成三元復合物(Cas13a/crRNA/target RNA)，同時，Cas13a 被激發(fā)反式剪切活性，將反應體系中任意序列的單鏈 RNA切碎。

3. 為防止 RNase 污染，請保持實驗區(qū)干凈整潔，操作時需穿戴干凈的手套、口罩，實驗所用槍頭、離心管等耗材均為 RNase-free。

4. Cas13a 蛋白對熱敏感，容易失活，應全程冰上配置反應體系，并在使用后立即將酶置于-20℃保存。

5. 本公司提供的 Cas13a 蛋白及反應緩沖液不含任何除 Cas13a 外的任何其它核酸酶活性。

6. 本產品僅供科研使用。