產(chǎn)品描述

Cas12b High Yield sgRNA Synthesis and Purification Kit是基于T7 RNA聚合酶的體外RNA轉(zhuǎn)錄試劑盒，可高效進行 Cas12b sgRNA 的制備。使用本試劑盒時，僅需按照本試劑盒說明書設(shè)計并合成 Target AntisenseOligo，每次反應(yīng)可獲得 50-150 μg 的 Cas12b sgRNA。獲得的 Cas12b sgRNA 可應(yīng)用于 CRISPR 分子診斷、基因編輯等。

產(chǎn)品組分

a. Cas12b Control Target Antisense Oligo 是陽性對照，可與 Cas12a Sense Oligo 退火后，作為轉(zhuǎn)錄模板使用，用來測試體外轉(zhuǎn)錄體系的反應(yīng)效率。在 37℃孵育 30 min 條件下，對照轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系生成的 crRNA 產(chǎn)量≥50 μg，其產(chǎn)量在純化后由NanoDrop 測定。在變性條件下進行 TBE-Urea gel 電泳，可觀察到 crRNA 單條帶大小約為 40 nt。

b. 本產(chǎn)品中 Part B 組分（純化磁珠，#3620F）與 Part A 組分保存條件不同，因此 Part B 組分需單獨運輸！

保存條件

Part A 組分-20℃保存，有效期 1 年。

需自備的實驗物品

PCR 儀

無水乙醇

異丙醇

無核酸酶水

96 孔磁力架

96 孔板或 PCR 8 聯(lián)排管

移液器及吸頭

Cas12b sgRNA 轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計

1.Cas12b sgRNA 轉(zhuǎn)錄原理示意圖

Cas12b sgRNA 轉(zhuǎn)錄原理示意圖如圖 1 所示，試劑盒中已提供 Cas12b Sense Oligo，只需根據(jù)待測目標序列設(shè)計 Target Antisense Oligo。

圖 1. Cas12b sgRNA 轉(zhuǎn)錄原理示意圖

2.Target Antisense Oligo 設(shè)計舉例

2.1 選取 20 bp 的 Target Sequence，其中方框部分為 PAM 序列，下劃線部分為 Target Sequence。

2.2 根據(jù)選取的 Target Sequence 設(shè)計 Target Antisense Oligo，則其序列應(yīng)為：

其中波浪線部分為 Cas12b sgRNA scaffold 的部分反向互補序列，為固定序列。下劃線部分為 Target Sequence。

2.3 轉(zhuǎn)錄得到的 Cas12b sgRNA 序列應(yīng)為：

波浪線部分為AapCas12b sgRNA scaffold 序列，下劃線部分為 Target Sequence 反向互補序列。

實驗流程

1.DNA 轉(zhuǎn)錄模板制備

Cas12b Sense Oligo 與 Target Antisense Oligo 退火延伸反應(yīng)完成后便可作為轉(zhuǎn)錄模板使用。

1.1 退火體系配制

1.2 PCR 退火程序設(shè)置

2.Cas12b sgRNA 體外轉(zhuǎn)錄

2.1 按下表試劑的順序進行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的配制：

· 請將試劑解凍并完全混勻后再使用。

· 5 × TranscriptMax Reaction Buffer 中含有亞精胺，而亞精胺與核酸容易形成復(fù)合體沉淀，DNA 轉(zhuǎn)錄模板盡量最后加入到體系中。

· 上述反應(yīng)體系的總體積為 20 μL，可適當?shù)缺壤{(diào)整反應(yīng)體系。

2.2 將上述試劑充分混勻，然后短暫離心，在 37℃下孵育 0.5-1 h 進行體外轉(zhuǎn)錄。

2.3 37℃孵育結(jié)束后，按照下表配制 30 μL 的 DNase Ⅰ反應(yīng)液加入到 20 μL 的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，以去除轉(zhuǎn)錄體系中的 DNA 模板。

DNase Ⅰ反應(yīng)條件：37℃，30 min。

 3.Cas12b sgRNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物磁珠純化

3.1 首先將磁珠從 4℃冰箱中取出，在室溫中放置約 30 min，使其溫度平衡至室溫。顛倒或渦旋振蕩使磁珠充分混勻，吸取 25 μL 磁珠和 50 μL 異丙醇加入到 50 μL 待純化的 crRNA 樣品中，用移液器吹打充分混勻。

3.2 室溫孵育 5 min，使 RNA 結(jié)合到磁珠上。

3.3 將樣品置于磁力架上 5 min，待溶液澄清后，小心移除上清。

3.4 保持樣品置于磁力架上，加入 200 μL 新鮮配制的 80%乙醇，漂洗磁珠，室溫孵育 30 s，小心移除上清。

注：漂洗時使用的 80% (v/v)乙醇需要使用 Nuclease-free water 新鮮配制，配制方法舉例如下：分別量取8 mL 無水乙醇和 2 mL Nuclease-free water，混勻后可得 10 mL 80% (v/v)乙醇。

3.5 重復(fù)步驟 4，共漂洗 2 次。

3.6 保持樣品始終處于磁力架上，開蓋空氣干燥磁珠 5 min。

注：磁珠開蓋晾干時要避免過分干燥，如果磁珠出現(xiàn)龜裂，則提示磁珠過分干燥，此時 RNA 的洗脫效率會降低。

3.7 將樣品從磁力架上取出，加入 50 μL Nuclease-free water，用移液器吹打以充分混勻，室溫靜置 5 min。

3.8 將樣品置于磁力架 5 min，待溶液澄清后，小心轉(zhuǎn)移上清至一個新的 Nuclease-free PCR 管中，即得到純化后的 Cas12b sgRNA。

注意事項

1. 本試劑盒制備的 sgRNA 為目前最常用的 AapCas12b sgRNA 或 AacCas12b sgRNA，如果要制備其它類型的 Cas12b sgRNA，只需要根據(jù) Cas12b sgRNA scaffold 序列重新設(shè)計 Cas12b Sense Oligo 與 Target Antisense Oligo 即可。

2. 本試劑盒的 Part B 組分（純化磁珠，#3620F）單獨運輸。磁珠保存條件為 2-8℃，嚴禁凍存和高速離心操作。

3. 由于 DNaseⅠ對不同 DNA 序列的消化能力存在差異，如果純化完成后仍然存在殘留模板 DNA，可以再次進行 DNaseⅠ處理，然后再次純化。

4. 轉(zhuǎn)錄模板的純度會顯著影響體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。例如模板 DNA 中混入 RNase、EDTA、NaCl 等高鹽溶液均可顯著抑制體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，導(dǎo)致 RNA 合成量減少。

5. 實驗過程應(yīng)選用無核酸酶的槍頭和離心管。